«117587, Москва, Варшавское ш., д.125ж, к.6 Тел./факс +7 (495) 980-45-55 Служба клиентской поддержки: 8 (800) 200-75-15 (звонок по ...»

117587, Москва, Варшавское ш., д.125ж, к.6

Тел./факс +7 (495) 980-45-55

Служба клиентской поддержки: 8 (800) 200-75-15

(звонок по России бесплатный)

E-mail: hotline@dna-technology.ru,

www.dna-technology.ru

Комплекты реагентов для проведения обратной транскрипции РНК и ПЦР–

амплификации кДНК HAV, HCV, HDV, HGV, HIV и ДНК HBV

Информация о комплектах

Назначение: Комплекты реагентов для проведения обратной транскрипции РНК и ПЦР–амплификации кДНК

HAV, HCV, HDV, HGV, HIV и ДНК HBV предназначены для проведения скринингового исследования на вирусы гепатитов HAV, HCV, HDV, HGV, HBV и на вирус иммунодефицита человека (HIV).

Скрининговое исследование состоит из следующих этапов:

1. Выделение ДНК/РНК: проводится с использованием комплекта реагентов ПРОБА–НК, укомплектованного двумя внутренними контролями РНК–ВК и ДНК–ВК.

2. Постановка обратной транскрипции: выполняется с использованием комплекта реагентов «ОТ–MIX», содержащего ОТ–праймеры для HAV, HCV, HDV, HGV и HIV.

3. ПЦР: проводится с комплектами реагентов, специфичными для каждой инфекции.

4. Детекция: осуществляется в зависимости от формата комплекта реагентов ПЦР. В зависимости от способа детекции результатов амплификации комплекты реагентов выпускаются в трех форматах (таблица 1) Таблица 1. Форматы комплектов реагентов Real– Форез Flash time HAV + + HBV + + + HCV + + + HDV + + HGV + HIV + + +

Состав комплектов (на 96 определений):

Реактив Количество Комплект реагентов для обратной транскрипции «ОТ–MI

Инструкция по применению 1. Выделение РНК/ДНК с использованием комплекта реагентов ПРОБА–НК В состав комплекта ПРОБА–НК входят два внутренних контрольных образца РНК–ВК и ДНК–ВК, которые добавляются в исследуемый образец на стадии выделения нуклеиновых кислот, что позволяет оценить качество всех этапов исследования.

При одновременном исследовании образца на наличие инфекций, вызванных РНК–содержащими вирусами (HAV, HCV, HDV, HGV и HIV) и ДНК–содержащими вирусами (HBV) необходимо на стадии пробоподготовки внести два внутренних контроля (РНК–ВК + ДНК–ВК).

При исследовании клинического материала только на наличие инфекций, вызванных РНК– содержащими вирусами (HAV, HCV, HDV, HGV и HIV) необходимо внести внутренний контроль РНК– ВК.

При исследовании клинического материала только на наличие инфекций, вызванных ДНК– содержащими вирусами (HBV) необходимо внести внутренний контроль ДНК–ВК.

Выделение РНК/ДНК для комплектов реагентов HАV, HDV и HGV производится в соответствии с инструкцией к комплекту реагентов ПРОБА–НК, для HBV, HCV и HIV – в соответствии с полными инструкциями для соответствующих наборов реагентов.

При выполнении п 6.1.17 Инструкции по применению комплекта реагентов ПРОБА–НК полученный осадок РНК/ДНК растворяется в 25 мкл буфера для растворения из комплекта ПРОБА–НК. Для проведения обратной транскрипции необходимо использовать 16,5 мкл препарата РНК/ДНК.

Для ПЦР–амплификации ДНК гепатита Б необходимо использовать 5,0 мкл из оставшегося объёма препарата РНК/ДНК.

2. Подготовка и проведение обратной транскрипции 2.1. Разморозьте содержимое пробирок «ОТ-буфер» и «Праймеры ОТ–HАV+HCV+HDV+HGV+HIV+дНТФ» из комплекта реагентов для обратной транскрипции при комнатной температуре (18–25 °С), затем встряхните пробирки на вортексе в течение 3–5 сек и центрифугируйте при 1000 об/мин в течение 1–3 сек.

2.2. Приготовьте ОТ-смесь. Смешайте в отдельной пробирке:

2,0х(N+1) мкл ОТ-буфера, 1,0х(N+1) мкл праймеров «Праймеры ОТ-HАV+HCV+HDV+HGV+HIV+дНТФ», 0,5х(N+1) мкл обратной транскриптазы, где N – количество анализируемых образцов с учётом «K–».

2.3. Встряхните пробирку на вортексе и центрифугируйте при 1000–3000 об/мин в течение 3–5 сек.

2.4. Добавьте по 3,5 мкл ОТ–смеси в пробирки с 16,5 мкл выделенной РНК/ДНК и в пробирку «К-».

Перемешайте пипетированием 5-7 раз.

2.5. Поместите пробирки в термостат и инкубируйте при 40 °С в течение 30 мин, затем прогрейте при 95 °С в течение 5 мин.

2.6. Осадите капли со стенок пробирок центрифугированием при 1000–3000 об/мин в течение 3-5 сек.

Полученный препарат кДНК готов для проведения ПЦР.

Внимание! При необходимости постановки ПЦР для выявления более четырёх инфекций следует:

1. К полученному препарату кДНК добавить 20 мкл буфера для растворения, таким образом, получив 40 мкл препарата ДНК.

2. Пробирки встряхнуть на вортексе в течение 3–5 сек, осадить капли центрифугированием при 1000– 3000 об/мин в течение 3–5 сек.

При необходимости допускается хранение кДНК при температуре минус 20 °С не более 1 мес.

- только модели 4S1; 4S2; 5S1; 5S2; 6S1; 6S2

- только модели 4M1; 4M3; 4M6; 5M1; 5M3; 5M6; 6M1; 6M3; 6M6 3 - по мере обновления программного обеспечения рекомендуемая версия ПО может измениться. Последнюю рекомендуемую версию ПО можно скачать на сайте компании «ДНК-Технология»: http://www.dnatechnology.ru/support/

3. Подготовка и проведение полимеразной цепной реакции

3.1. Промаркируйте для каждого исследуемого образца, отрицательного контрольного образца («K–») и положительного контрольного образца («K+») по одной пробирке с запечатанными парафином смесями для амплификации.

Внимание! При использовании для учёта результатов амплификации детектора флуоресцентного (формат «Flash») необходимо промаркировать дополнительно две пробирки с запечатанной парафином смесью для амплификации (две нормировочные пробирки «ФОН») для контроля фона флуоресценции.

3.2. Встряхните пробирки с ПЦР-буфером и полимеразой ТехноTaq, затем центрифугируйте при 1000 об/мин в течение 1–3 сек на микроцентрифуге/вортексе.

3.3. Приготовьте смесь ПЦР-буфера с полимеразой ТехноTaq. Смешайте в отдельной пробирке:

10х(N+1) мкл ПЦР–буфера, 0,5х(N+1) мкл полимеразы ТехноTaq, где N – количество анализируемых образцов с учётом «K–» и «К+».

3.4. Добавьте в каждую пробирку (за исключением пробирок «ФОН»), не повреждая слой парафина, по 10 мкл смеси ПЦР-буфера с полимеразой ТехноTaq. В пробирки, маркированные «ФОН», добавьте по 10 мкл ПЦР-буфера.

3.5. Добавьте в каждую пробирку по 1 капле (около 20 мкл) минерального масла. Закройте крышки пробирок.

3.6. Для предотвращения контаминации следует перед внесением кДНК/ДНК открывать крышки только тех пробирок, в которые будет вноситься данный образец, и закрывать их перед внесением следующего.

Препараты кДНК/ДНК следует вносить наконечниками с аэрозольным барьером.

Внесите в соответствующие пробирки для исследуемых образцов, не повреждая слой парафина, по 5,0 мкл выделенного из образцов и предварительно перемешанного препарата кДНК/ДНК.

3.7. Внесите, не повреждая слой парафина, по 5,0 мкл предварительно перемешанного отрицательного контрольного образца, прошедшего этапы выделения РНК и обратной транскрипции, в пробирки, маркированные «K–» и «ФОН». Внесите, не повреждая слой парафина, 5,0 мкл предварительно перемешанного положительного контрольного образца в пробирку, маркированную «K+».

3.8. Центрифугируйте пробирки на микроцентрифуге/вортексе в течение 1-3 сек.

3.9. Установите все пробирки в амплификатор или термостат программируемый.

3.10. Форматы «Форез» и «FLASH».

Проведите ПЦР с учётом объёма реакционной смеси, равного 35 мкл (Таблица 3). Алгоритм регулирования «Быстрый», объём реакционной смеси 35 мкл.

3.11. Формат «Real-time».

Для приборов ДТ-322, ДТлайт, ДТпрайм и ДТ-96:

Запустите программное обеспечение RealTime_PCR в режиме «Работа с прибором». При первом проведении ПЦР загрузите ini файл c соответствующим названием. При последующих постановках добавьте в протокол соответствующий тест, укажите количество и идентификаторы образцов, в том числе положительного и отрицательного контрольных образцов, отметьте расположение пробирок на матрице термоблока в соответствии с их установкой (см. п. 3.9) и проведите ПЦР.

Для приборов iQ, iQ5:

Включите прибор и блок питания оптической части прибора, оставьте для прогрева на 30 минут. Запустите программное обеспечение iCycler (или Bio-Rad iQ5). При первом проведении ПЦР создайте и сохраните новый протокол. При последующих постановках выберите сохраненный протокол, настройте конфигурацию плашки (файл с данными о характеристике образцов и их расположении в плашке) и проведите ПЦР с учётом объёма реакционной смеси, равного 35 мкл (Таблицы 4, 5).

4. Регистрация и учёт результатов ПЦР.

Формат «Форез»: результаты анализируют методом горизонтального гель–электрофореза (см. таблицу 2 и инструкцию для проведения гель-электрофореза).

Формат «FLASH»: с помощью ПЦР-детектора «Джин», «Джин-4» согласно инструкции к прибору.

Формат «Real-time»: на приборах ДТ-322, ДТлайт, ДТпрайм и ДТ-96 или iCycler iQ, iQ5 согласно инструкциям к приборам.

Условия хранения и эксплуатации Комплекты реагентов для обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, за исключением пробирок со смесью для амплификации, запечатанной парафином, и положительных контрольных образцов, следует хранить при температуре минус 20 °С в течение всего срока годности. Допускается многократное замораживание ПЦРбуфера и минерального масла.

Пробирки со смесью для амплификации, запечатанной парафином, и положительные контрольные образцы следует хранить в тёмном месте при 2–8 °С в течение всего срока годности. Допускается хранение пробирок со смесью для амплификации, запечатанной парафином, при температуре 18–25 °С.

Срок годности комплектов – 9 мес. с даты изготовления.

По вопросам, касающимся качества комплектов реагентов для проведения обратной транскрипции РНК и ПЦР– амплификации кДНК, следует обращаться к официальному представителю производителя по адресу:

ООО «ДНК-Технология», 117587, Москва, Варшавское шоссе, д.125ж, к.6, тел./факс +7 (495) 980-45-55, www.dna-technology.ru Служба клиентской поддержки: 8 (800) 200-75-15 (звонок по России бесплатный), E-mail: hotline@dna-technology.ru Анкета для осуществления обратной связи находится на сайте компании «ДНК-Технология»: http://www.dnatechnology.ru/support/ Таблица 2.

94,0 0 10 94,0 0 10 2 58,0 0 25 50 62,0 0 20 64,0 0 15