«УТВЕРЖДАЮ Гла “ “ санитарный врач йеной Федерации Первый здравоохранения Йеной Федерации Г.Г. Онищенко JliyhL. Ц.'1 МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ФЕНМЕДИФАМА В КОРНЕПЛОДАХ И ЗЕЛЁНОЙ ...»

УТВЕРЖДАЮ

Гла “ “ санитарный врач

йеной Федерации

Первый здравоохранения

Йеной Федерации

Г.Г. Онищенко

JliyhL. Ц.'1

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ФЕНМЕДИФАМА

В КОРНЕПЛОДАХ И ЗЕЛЁНОЙ МАССЕ СТОЛОВОЙ И КОРМОВОЙ СВЁКЛЫ

МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

1. Вводная часть. Кратк и характеристика препарата Фирма - производитель: Авентис КропСайенс ГмбХ, Торговое название препаратов: Бетанал С, Бетанал AM 11, Бетаяал 22, Бетанал Прогресс AM, Бетанал Прогресс ОФ, Бетарен Экспресс AM, Бурефен ФД 11.

Название действующего вещества по ИСО: Фенмедифам.

Н3С Название действующего вещества по ИЮПАК: метил-3-(3-метилкарбанилокси)-карбанилат;

3-метоксикарбониламинофенил-З *-метилкарбанилат Эмпирическая формула: C 1 6 H16N2O4.

Молекулярная масса 300,3.

Химически чистый Фенмедифам представляет собой бесцветное кристаллическое вещество с температурой плавления 143-144°С.

Коэффициент распределения в системе н-октанол - вода Kow togP= 3,59 (pH 9), Давление насыщенных паров: 1,33x1 O мПа (при 25°С), '6 Константа Генри (расчетная) 5x1 О Па* м3 * моль'1. рКа менее ОД.

*8 Растворимость в воде 4,7 мг/л (при комнатной температуре).

оценка дома Растворимость (при 20 0 С в г/кг); в ацетоне 200; циклогексаноне 200; этшшцетате 56,3; метаноле 50; хлороформе 20; дихлорметане 16,7; толуоле 0,97; гексане 0.5.

Стабилен при температуре ниже 200°С. Очень стабилен в кислых растворах, но гид­ ролизуется в нейтральных и щелочных растворах; D Tsq (при 22°С) 50 суток (pH 5), 14,5 часов (pH 7), 10 минут (pH 9).

Краткая токсикологическая характеристика: Фенмедифам относится к малоопасньш веществам по острой пероральной токсичности (ЛДзо для крыс и мышей - более 8000 мг/кг, свиней и собак - более 4000 мг/кг) и умеренно опасным веществам по острой дермальной (ЛД5о для кроликов 1000 мг/кг) и ингаляционной токсичности (ЛК50 (4 часа) для крыс 7000 мг/м3 воздуха). Не раздражает кожу.

Фенмедифам метаболизнруется в почве и растениях, в частности, в свёкле. Продук­ тами метаболизма являются метил-Н-(3-гидроксифенил)карбамат и м-амияофенол, а также комплексы с компонентами почвы. DT5o в почве - до 25 суток, DT90 - до 108 суток. Фенме­ дифам не аккумулируется в почве и не передвигается в растения. Риск проникновения в грунтовые воды отсутствует. В организмах млекопитающих основные пути метаболизма гидролиз до метил-Ы-(3-пздроксифенил)карбамата и конъюгация до глкжуронидов. 99% Фенмедифама и его метаболитов выводятся из организма с мочой в течение 72 часов.

В России установлены следующие гигиенические нормативы: ДСД ~ 0,03 мг/кг/сутки; ПДК в почве - 0,25 мг/кг (транслокационный лимитирующий показатель); ПДК в воде водоёмов - 0,05 мг/дм3; ПДК в воздухе рабочей зоны - 0,50 мг/м3; ОБУВ в атмосфер­ ном воздухе - 0,001 мг/м3, МДУ в сельскохозяйственной продукции (мг/кг): свёкла сахарная, столовая, кормовая - 0,20 мг/кг; цикорий, цикорий салатный - 0,50 мг/кг.

Область применения препарата: Фенмедифам используется в качестве послевсходового гербицида в посевах сгчарной, столовой и кормовой свёклы. Подавляет развитие широко­ листных сорняков, действуя через листья. Двудольные сорняки чувствительны к Феемедифаму от фазы всходов до образования четырёх настоящих листьев, злаковые - в фазе появ­ ления первого листа.

Зарегистрирован в России под торговыми названиями; (в смеси с Десмедифамом):

«Вставал AM 11, КЭ (80+80 г/л)», «Бетанал 22, КЭ (160+160 г/л)», «Бурефен ФД И, КЭ (80+80 г/л)»; (в смеси с Десмедифамом и Этофумезатом): «Бетарен Экспресс AM, КЭ (60+60+60 г/л)». Рекомендуется применение с нормой расхода препарата до б л/га, до трех обработок за сезон (по ка:ч сдоЙ волне сорняков).

Z М етод и ка определения остато ч н ы х коли честв Ф ен м ед и ф ам а в корнеп лодах и зелёной м ассе столовой и кор м овой св ёк л ы м етодом газож и дкостн ой хр о м ато гр аф и и

2.1. Основные положения.

2.1.1. Принцип метода.

М етодика основ#' in на выделении Фенмедифама из анализируемых проб методом экстракции органическим растворителем, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающими г я жидкими фазами, получении химического производного путём гидролитического расщег тения Фенмедифама в 3-метиланилии и бромирования последнего.

Определение производного Фенмедифама производится методом газожидкостной хром ато­ графии с использованием электронозахватного детектора. Идентификация вещ ества п рово­ диться по временя удерж твания. Количественное определение осуществляется методом аб­ солютной калибровки.

2.1.2. Метрологическая хг оактеристика метода.

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2. Число парал­

–  –  –

2.1.3. Избирательность ме года.

В предлагаемых у ;ловлях метод специфичен в присутствии пестицидов близких по химическому строению {.* грбаматы), а также и других применлемых при возделывании сто­ ловой и кормовой свёклы.

2.2. Реактивы, растворы, о горудование и приборы.

2.2.1. Реактивы, растворы %материалы, Ацетон х.ч., ТУ 6-09-3513-Н6.

Ацетонитрил х.ч., ТУ 6-01"-3534-74 или для ВЭЖХ «В-230НМ».

н-Гексанх.ч.,ТУ 6-09-3375-78.

Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-72, Калия бромат, х.ч., ГОСТ 1457-74.

Калия бромат, 1% раствор в дистшшированной воде.

Калия бромид, х.ч., ГОСТ;4160-74.

Калия бромид, 20% раствор в дистиллированной воде.

Калия гидроксид (кали едкое), гранулированный, ч.д.а., ОСТ 6-01-301-74.

Кислота серная, концентрированная, х л „ ГОСТ 14262-78 Кислота серная, 1 н раствор в дистиллированной воде.

Кислота хлороводородная (соляная), концентрированная, х.ч., ГОСТ 3118-77.

Кислота хлороводородная, 0,05 н раствор в дистиллированной воде.

Натриягндрокснд (натр едкий), х.ч., ГОСТ 4328-77 Натрия гидроксид, 10 н и 1 и растворы в дистиллированной воде.

Натрия сульфат (натрий сернокислый) безводный, ч.д.а., ГОСТ 4166-76.

Натрия сульфит (натрий серноватистокислый), ч.д.а,, ГОСТ 27068-86.

Натрия хлорид, ГОСТ 4233-77.

Толуол, х.ч., ГОСТ 5789-73.

Фенмедифам, аналитический стандарт с содержанием д.в. не менее 99,8%, фирма Авентис КропСайенс ГмбХ.

Фильтры бумажные, ТУ 6-09-1678-77, Этилацетат (этиловый эфгр уксусной кислоты), ГОСТ 223000-76.

Этиленгликоль, ГОСТ 10V64-75.

Эфир диэтиловый медицинский, ГОСТ 6265-74 2.2.2. Приборы, оборудование и посуда.

Хроматограф “ Кристалл 2'ДООМ” с электронозахватным детектором.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая SE -3 0,25 м (ООО «Предприятие Химресурс XX I», 109429, Россчя, г. Москва, ул. Верхние Поля, 24, тел. 359-17-56).

Баня водяная, ТУ 64-1-2850-76.

Баня песчаная.

Ванна ультразвуковая «Серьга» ТУ 3.836.008 или аналогичная.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80 Е или аналогичные.

Весы лабораторные общего назначения, с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности + 0,038 г, ГОСТ 19491-74.

Воронки делительные на 250 мл, ГОСТ 25336-82 Е.

Воронки конические, стеклянные диаметром 50-60 мм, ГОСТ 25336-082Е.

Встряхиватель механический, ТУ 64-673М или аналогичный.

Испаритель ротационный вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-76 или аналогичный, Колбы круглодонные со шлифами, ГОСТ 9737-70.

Колбы мерные на 100 мл, 50 мл и 25мл, ГОСТ 1770-74.

Колбы плоскодонные конические со шлифами, ГОСТ 9737-70, Концентраторы грушевидные и круглодонные, объемом 50, 100 и 250 мл, КТУ-100-14/19, ГОСТ 10394-75.

Микрошприц для газожидкостного хроматографа на 5-10 мкл.

Насос вакуумный водоструйный, ГОСТ 25336-82 Е.

Палочки стеклянные, ГОСТ 25336-82Е.

Пипетки на 1,2,5 и 10 мл, ГОСТ 22292-74.

SO Стаканы стеклянные на 100-500 мл, ГО СТ 25366-80Е.

Цилиндры мерные на 2 5,5 0, 100 и 500 мл, ГОСТ 1770-74 Е.

2.3. Отбор проб.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (№ 2051-79 от 21.08.79}.

Отобранные пробы столовой и кормовой свёклы анализируются в день отбора или могут храниться в холодильнике при +4°С в течение 3 дней. Для длительного хранения про­ бы замораживают и хранят при температуре -18°С. Непосредственно перед определением пробы корнеплодов столовой и кормовой свёклы и капусты измельчают на тёрке. Пробы зе­ лёной массы измельчают ножницами.

2.4. Подготовка к определению.

2.4.1. Приготовление щелочного этиленгликоля.

Растворяют 1 г гранулированного гидроксида калия в 1 мл дистиллированной воды и доводят объём до 25 мл этиленгликолем.

2.4.2, Приготовление стандартных и градуировочных растворов.

2.4.2.1. Приготовление стандартных растворов Фенмедифама в ацетоне.

Взвешивают 50 мг Фенмедифама в мерной колбе на 50 мл, интенсивно встряхивая, растворяют навеску в ацетоне и доводят объём до метки ацетоном. (Стандартный раствор №1 с концентрацией Фенмедифама 1,0 мг/мл). Стандартный раствор JSfe 1 можно хранить в холодильнике в течение б месяцев в плотно зак р ы той посуде.

Переносят 1 мл стандартного раствора №1 в мерную колбу на 100 мл и ацетоном до­ водят до метки. (Стандартный раствор Гй2 с концентрацией Фенмедифама 10 мхг/мл). Ана­ логично, методом последовательных разбавлений, готовят стандартные растворы Фенмеди­ фама в ацетоне с концентрациями: 4,0; 2,0; и 1,0 мкг/мл. Стандартные растворы с концентра­ циями 0,25 - 10,0 мкг/мл устойчивы на холоде в тёмной посуде не более 2 недель.

Стандартные растворы Фенмедифама в ацетоне используют для получения градуи­ ровочных растворов и для внесения в корнеплоды и зелёную массу столовой и кормовой свёклы при отработке и апробации методики.

2.4.2.2. Приготовление градуировочных растворов.

В концентратор добавить 1 мл стандартного раствора Фенмедифама в ацетоне с кон­ центрацией 1,00 мкг/мл. Содержимое концентратора упарить досуха на ротационном вакуя умном испарителе при температуре не выше 30°С. Последовательно перенести тремя пор­ циями по 2 мл диэтилового эфира содержимое концентратора в термостойкую колбу с плот­ но пришлифованной пробкой. Током теплого воздуха высушить содержимое колбы. Под­ вергнуть Фенмедифам щелочному гидролизу. Для этого добавить в колбу 1 мл этиленглико­ ля и 1 мл щелочного этиленгликоля. Колбу плотно закрыть крышкой и поместить её в песча­ ную баню с температурой 180°С на 15 минут. По прошествии этого времени колбу охладить до комнатной температуры. Подвергнуть образовавшийся после гидролиза 3-мети лани л ин бромированию, при этом все р аботы следует вы п олн ять в вы тяж н ом ш кафу. В колбу до­ бавить 10 мл 1 н серной кислоты, 1 мл бромида калия и 1 мл бромата калия. Содержимое колбы тщательно перемешать и поместить её в темное место на 15 минут. После бромирования избыток брома удаляют сухим сульфитом натрия. Сульфит натрия добавляют неболь­ шими порциями перемешивая колбу до полного исчезновения жёлтой окраски. В колбу до­ бавляют 1,5 мл Ю н раствора гидроксида натрия, Аккуратно перемешивают содержимое колбы. Экстрагируют бронированный продукт 4 мл толуола. Получают градуировочный рас­ твор с концентрацией 0,25 Мкг/мл, в пересчёте на Фенмедифам.

Аналогичным об ;ш о м готовят градуировочные растворы с концентрациями 0,50, 1,00 и 2,50 мкг/мд (в пересчёте на Фенмедифам). Для этого берут по 1 мл стандартных рас­ творов с концентрациями 2,0,4,0 и 10,0 мкг/мл, соответственно.

Градуировочные растворы используют для построения калибровочного графика.

2.4.3. Подготовка и конди. -чонирование колонки для газожидкостной хроматографии.

Капиллярную квардевую колонку SE -3 0,25 м устанавливают в термостате хромато­ графа и стабилизируют при температуре 180°С, давлении газа носителя (Газ 1) 80 кПа, рас­ ходе газа носителя (Газ 2) 5,5 мл/мин, сбросе 1:20 и поддуве (Газ 3) 30 мл/мин в течение б часов, 2.4.4. Построение калибровочного графика.

Для построения калибровочного графика (площадь пика - концентрация градуиро­ вочного раствора в Перес сте на Фенмедифам) вводят в хроматограф по 1 мкл градуировоч­ ных растворов. Измеряют площадь пиков (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации). Строят гр ф и к и зависимости площади хроматографического пика от расчёт­ ной концентрации Фекме, дфама.

2.5. Описание определения.

2.5.1. Ботва я корнеплоды столовой и кормовой свеклы.

Измельчённый образец корнеплодов или зелёной массы столовой (кормовой) свек­ лы, массой 20 г помещают в коническую колбу объёмом 250 мл. В колбу вносят 5-10 мл 0,05 н раствора соляной кислоты. Прибавляют 40 мл смеси ацетонитрил - 0,05 н соляная кислота в соотношении 9:1 и помещают колбу на 5 минут в на ультразвуковую ванну, затем экстраги­ руют Фенмедифам в течение 20 минут на качалке. Процедуру экстракции повторяют ещё 2 раза, используя по 30 мл ацетонитрила. Экстракты фильтруют через бумажный фильтр «красная лепта» в делительную воронку на 250 мл.

В делительную всронку добавляют приблизительно 3 г хлорида натрия, интенсивно встряхивают в течение 30 секунд.

После разделения слоёв нижний водный слой с остатками не растворившегося хлор: да натрия отбрасывают, К оставшемуся в делительной воронке ацетонитрильному слою прибавляют 40 мд гексана и интенсивно встряхивают в течение 1 минуты. После полного разделения слоёв нижний ацетонитрильныл слой собирают в химический стакан объёмом 200 мл. Верхний гексановый слой отбраснгают. Ацетонитрильный экстракт из химического стакана снова переносят в делительную воронку. Повторяют процедуру промывки ацетонитрильного экс­ тракта гексаном ещё 2 р.юа, используя по 30 мл гексана. Песле завершающей промывки нижний ацетонитрильный слой собирают в концентратор на 100 мл, пропуская его через слой безводного сульфата натрия.

Ацетонитрильный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарите­ ле при температуре не в ь г « 30°С.

В концентратор добавляют 2 мл ацетона, тщательно растворяют сухой остаток. Для лучшего растворения кон центратор помещают на У минуты в ультразвуковую ванну. Содер­ г жимое концентратора аккуратно переносят в делительную воронку. В концентратор повтор­ но добавляют 2 мл ацетона, тщательно обмывают стенки. Содержимое переносят в ту же делительную воронку. К объединенным порциям ацетона добавляют 100 мл 1 н раствора гидроксида натрия (pH 9) в дистиллированной воде. Плавно встряхивают в течение 1 мину­ ты.

В делительную воронку добавляют 40 мл этилацетата. Интенсивно встряхивают в те­ чение 1 минуты. Оставляют делительную воронку в покое. После полного разделения слоёв нижний водный слой собирают в химический стакан объёмом 200 мл. Верхний слой собира­ ют в концентратор на 25С мл, пропуская его через слой безводного сульфата натрия. Содержимое химического стакана снова переносят в делительную воронку. Повторяют процедуру экстракции Фенмедифамп ещё 2 раза, используя по 30 мл этилацетата. Все слои этилацетата объединяют в концентраторе на 100 мл. Процедуру эк с т р а к ц и и следует п р о во д и ть по возм ож ности бы стро.

Этилацетат упаригают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30°С досуха. Остатки растворителя отд уваю т из к о н ц ен тр а то р а воздухом к о м н а т ­ ной те м п е р ату р ы не менее Э м и н ут.

Получение произвецщых Фенмедифама.

Содержимое концентратора последовательно перенести тремя порциями по 2 мл диэтилового эфира в термостойкую колбу с плотно пришлифованной пробкой. Током теплого воздуха высуш ить содержимое колбы. Подвергнуть Ф енмедифам щелочному гидролизу. Для этого добавить в колбу 1 мл этиленгликоля и 1 мл щ елочного этиленгликоля. Колбу плотно закрыть крышкой и пометгить её в песчаную баню с температурой 180°С на 15 минут. По прошествии этого времен i колбу охладить до комнатной температуры. Подвергнуть образо­ вавшийся после гидролиза 3-метиланилин бромированию, при этом все р аб о ты сл едует

–  –  –

калия и 1 мл бромата калия. Содержимое колбы тщ ательно перемеш ать и поместить её в темное место на 15 ми ну а После бромирования избыток бром а удаляют сухим сульфитом натрия. Сульфит натрия, убавляю т небольшими порциями перемешивая колбу до полного исчезновения жёлтой окр 'ски. В колбу добавляют 1,5 мл Ю н раствора гидроксида натрия.

Аккуратно перемешиваю содержимое колбы. Экстрагируют бромированный продукт 4 мл толуола. Из слоя толуолг микрошприцом отбирают аликвоту 1 мкл и вводят её в хроматограф.

2,6. Условия хроматограф, оования и обработка результатов.

2,6,1, Условия хроматогрсфироваяия.

Хроматограф “ Кристалл дОООМ” с электронозахватным детектором или другой с аналогич­ ными характеристиками.

Капиллярная кварцевая ке донка SE-30, длина 25 м.

Температура детектора - ^.40°С, испарителя - 210°С, программированный нагрев колонки - с 180°С (const 3 мин) до 2 К °С по 10 град./мин, 210°С const 6 мин.

Газ 1: тип регулятора расхода газа РРГ 11, давление 80 кПа.

Газ 2 (азот) - 10 мл/мин: расход 0,5 мл/мин, сброс 1 ;20.

–  –  –