WWW.BOOK.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные ресурсы
 


Pages:   || 2 |

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ Учреждение образования «Гомельский государственный университет им. Ф. Скорины» Г. Г. Гончаренко ОСНОВЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ Методическое пособие ...»

-- [ Страница 1 ] --

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

Учреждение образования

«Гомельский государственный университет им. Ф. Скорины»

Г. Г. Гончаренко

ОСНОВЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ

ИНЖЕНЕРИИ

Методическое пособие

Гомель

Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии

УДК 575+663.1 (075.8)

ББК 28.041.12+30.16я73

Г 657

Рецензенты:

Чл.-корр. РАН, проф. Л. И. Корочкин (ИБГ РАН, Москва) Чл.-корр. НАН Б, проф. А.В.Кильчевский (БГСХА, Горки) Кафедра биотехнологии и экологии БГСХА, Горки Рекомендовано научно-методическим советом УО «ГГУ им. Ф. Скорины»

Гончаренко Г. Г.

Основы генетической инженерии. Методическое пособие /Отв.ред.

Г 657 Л.В. Хотылева.– Гомель: УО «ГГУ им. Ф.Скорины», 2003. – 118 с.

Методическое пособие по основам генетической инженерии предназначено для студентов дневной и заочной форм обучения биологического факультета. Основная цель пособия – помочь студентам углубить и закрепить теоретические знания по предмету, познакомить с современными методами генной инженерии. Данное пособие включает шесть практических занятий. Каждое занятие состоит из теоретического блока и задач по теме. В конце пособия приведены тесты для самопроверки усвоенных знаний и подробный глоссарий современных генетических терминов.

Адресовано студентам и аспирантам специальности биология. Может быть использована для специальностей генетика, молекулярная биология и биотехнология.

Табл. 2. Ил. 44.

УДК 575+663.1 (075.8) ББК 28.041.12+30.16я73 © Г. Г. Гончаренко, 2003 ©УО «Гомельский государственный Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 7 университет им. Ф. Скорины», 2003 Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии СОДЕРЖАНИЕ Предисловие ……………………………………………………………...... 3 Введение …………………………………………………………………... 5 Занятие 1. Основы молекулярной генетики …………………………….. 7 Теоретическая часть с решениями типовых задач к занятию 1 ………….. 7 Задачи для самоконтроля к занятию 1 ……………………………………… 11 Занятие 2. Ферменты рестрикции и получение гибридной ДНК …… 17 Теоретическая часть с решениями типовых задач к занятию 2 ………… 17 Задачи для самоконтроля к занятию 2 ……………………………………… 21 Занятие 3. Анализ и использование фрагментов ДНК (ДНКовых последовательностей) ……………………………………………………………. 25 Теоретическая часть с решениями типовых задач к занятию 3 ………… 25 Задачи для самоконтроля к занятию 3 ……………………………………… 32 Занятие 4. Вектора – специальные устройства для доставки чужеродных генов в различные организмы …………………………………..………. 39 Теоретическая часть с решениями типовых задач к занятию 4 ………… 39 Задачи для самоконтроля к занятию 4 ……………………………………… 45 Занятие 5. Фаговые и космидные вектора и создание геномных библиотек ……………………………..………

Теоретическая часть с решениями типовых задач к занятию ………… 51 Задачи для самоконтроля к занятию 6 ……………………………………… 57 Занятие 6. Генная дактилоскопия и полный сиквенс (прочтение) нуклеотидных последовательностей ДНК ……………………………..………. 63 Теоретическая часть с решениями типовых задач к занятию 6 ………… 63 Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 9 Задачи для самоконтроля к занятию 6 ……………………………………… 68 Тесты для самопроверки усвоенного материала …………………….... 75 Ответы на задачи повышенной сложности…………………………….. 91 Глоссарий терминов по генетической инженерии и молекулярной генетике……………………………………………………………………….. 97 Содержание ……………………………………………………………... 115 Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии

–  –  –





ПРЕДИСЛОВИЕ

Предлагаемое методическое пособие к общему курсу «Введение в биотехнологию и генетическую инженерию», который преподается на четвертом курсе студентам биологического факультета, ставит своей целью облегчить студентам усвоение современного материала по этому, интенсивно развивающемуся предмету. Данное пособие предназначено как для использования во время проведения практических занятий, так и для самостоятельной подготовки студентов.

Методическое пособие включает 6 четырехчасовых занятий. В начале каждого занятия развернуто ставится цель. Занятие начинается с соответствующей теоретической части, в которой последовательно, по мере усложнения, излагается материал, включающий знакомство с методами и технологиями, использующимися для проведения современных генноинженерных экспериментов, даются определения современных молекулярногенетических терминов, которые способствуют усвоению данной темы. Для более глубокого усвоения материала приводятся задачи с подробными решениями. Практическая часть каждого занятия состоит из специализированных задач разного уровня сложности. Отдельным блоком даются задачи повышенной сложности. В конце занятия приводятся литературные источники, из которых студенты могут почерпнуть дополнительные сведения по изучаемой теме. В заключительную часть пособия включены разработанные тесты для самопроверки усвоенных знаний и подробный глоссарий.

При подготовке методического пособия автор использовал соответствующие издания по генной инженерии, молекулярной биологии и биотехнологии: Баев А.А. Генетическая инженерия. Москва. Знание, 1986;

Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды: М.: Мир, 1987; Уотсон Дж., Туз Дж., Курц Д. Рекомбинантные ДНК. Краткий курс: Пер. с англ.- М.: Мир, 1986; Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика: Пер. с англ.: В 3 т.

– М.:

Мир, 1988; Льюин Б. Гены: – Пер. с англ. – М.: Мир, 1987; Картель Н.А.

Биоинженерия: методы и возможности. Мн.: Ураджай, 1989; Картель Н.А. и др. Генетика. Энциклопедический словарь. Мн.: Тэхналогiя, 1999; Кочергин

Б.Н., Кочергина Н.А. Задачи по молекулярной биологии и генетике. Мн.:

Народная асвета, 1982; Методы молекулярной генетики и генной инженерии/ Мазин А.В. и др. – Новосибирск: Наука, 1990; Соколовская Б.Х. Сто задач по генетике и молекулярной биологии. – Новосибирск: Наука, 1971; Жимулев

И.Ф. Общая и молекулярная генетика: Учебное пособие. – Новосибирск:

Издат. Новосиб. универ., 2002; Песецкая Л.Н., Гончаренко Г.Г. Сборник задач по генетике. Гомель: ГГУ, 2002; Рыбчин В.Н. Основы генетической Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 11 инженерии: Учебное пособие. – Мн.: Выш. шк., 1986; Щелкунов С.Н.

Конструирование гибридных молекул ДНК. – Новосибирск: Наука, 1987;

Modern genetic analysis/ Griffiths et al. – Freeman and company. New York. 1999;

Principles of genetics/ Snustad P., Simmons M. Second edition – John Wiley & Sons. New York. 1999; An introduction to genetic analysis/ Griffiths et al. – Freeman and company. New York. 2000. Следует отметить, что литература по генетической инженерии и биотехнологии в настоящее время издается малыми тиражами и труднодоступна.

Данное учебное пособие формировалось постепенно в процессе проведения занятий по соответствующим генетическим курсам для студентов биофака ГГУ с 1999 по 2003г. Работе над пособием также способствовали благоприятные и многолетние контакты с коллегами молекулярными генетиками Беларуси и России. Существенным стимулом для издания учебного пособия послужил интерес, проявленный студентами для которых читались эти курсы. Их ответы на экзаменах, конструктивные вопросы и замечания в ходе практических занятий позволили постоянно улучшать учебный материал по такой бурно развивающейся современной дисциплине как генетическая инженерия и биотехнология.

В заключении следует сказать, что учебно-методическому пособию была дана благосклонная оценка рядом ведущих отечественных и зарубежных генетиков. В связи с этим автор считает своим приятным долгом выразить признательность Л.В. Хотылевой, Н.А. Картелю, И.Д. Волотовскому, О.Г.

Давыденко и А.В. Кильчевскому (Беларусь), Н.П. Дубинину, Л.И. Корочкину (Россия), а также В.Х. Викслеру (Германия), Ю.И. Лобкову, В.Х. Рошке, М.З.

Людвигу (США) и В. Наглю (Австрия) за поддержку и ряд полезных советов и предложений, направленных на улучшения данного учебно-методического пособия. Особая благодарность аспирантам гомельского университета Александру Суркову и Сергею Никоновичу, которые оказывали плодотворное содействие на многих этапах работы над учебным пособием.

–  –  –

ВВЕДЕНИЕ В 40-е и особенно 50-е годы прошлого столетия в биологию пришли методы точных наук: химии, физики, математики, Стало возможным исследовать жизнь на молекулярном уровне, результатом чего стали замечательные открытия.

Самое яркое из них – установление факта, что материальным носителем генетической информации в клетке является ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота). Это открытие стало основой зарождения и бурного развития в начале 50-х годов молекулярной биологии и молекулярной генетики. Успехи этих наук предопределили возникновение и развитие генетической инженерии. Благодаря достижениям генетической инженерии и биотехнологии стали успешно решаться вопросы производства продуктов питания за счет создания высокопродуктивных трансгенных штаммов, сортов растений и пород сельскохозяйственных животных, начато успешное лечение наследственных заболеваний на генном уровне, а также конструктивно разрабатываются вопросы управления генофондами популяций наиболее ценных животных и растений.

Что же такое генетическая инженерия? Когда и как она возникла и что из себя представляет?

Генетическая инженерия – это конструирование искусственным путем функционально активных генетических структур и наследственно измененных организмов. Другими словами, сущность генетической инженерии состоит в целенаправленном конструировании особых гибридных молекул вне организма (как принято говорить in vitro, "в пробирке") с последующим их введением в живой организм. При этом гибридные молекулы (рекомбинантные ДНК) становятся составной частью генетического аппарата данного организма. В результате наследственная программа организма изменяется, ему сообщаются новые генетические, а следовательно, биохимические и физиологические свойства. Таким образом, цель генетической инженерии – создание рекомбинантных ДНК, которые придали бы организму новые, полезные для человека свойства.

Генетическая инженерия впитала в себя достижения целого ряда биологических дисциплин. Ее корни: биохимия, генетика, цитология, эмбриология, вирусология, молекулярная биология и молекулярная генетика.

Термин "генетическая инженерия" появился в научной литературе где-то около 1970 г., а генетическая инженерия как самостоятельная дисциплина возникла в декабре 1972 г., когда ученые Джексон, Симонс Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 13 и Берг из Стенфордского университета (США) опубликовали работу о создании искусственным путем первой рекомбинантной (гибридной) молекулы ДНК. Эта молекула состояла из фрагментов ДНК, взятых у вируса sv-40, бактериофага и бактерии под названием кишечная палочка E. coli.

–  –  –

Литература

1. Баев А.А. Генетическая инженерия. Москва. Знание. 1986. – 82 с.

2. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды: М.: Мир, 1987 – 411 с.

3. Уотсон Дж., Туз Дж., Курц Д. Рекомбинантные ДНК. Краткий курс: Пер. с англ.- М.: Мир, 1986.- 288 с., ил.

4. Картель Н.А. Биоинженерия: методы и возможности. Мн.: Ураджай, 1989.с.

5. Льюин Б. Гены:

- Пер. с англ.- М.: Мир, 1987.- 544 с., ил.

6. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии: Учеб. пособие для вузов.Мн.: Выш. шк., 1986.- 186 с.: ил.

7. Modern genetic analysis/ Griffiths et al. – Freeman and company. New York.

1999. – 675 p.

8. Principles of genetics. Snustad P., Simmons M. / Second edition – John Wiley & Sons. New York. 1999. – 876 p.

9. An introduction to genetic analysis. Griffiths et al. – Freeman and company. New York. 2000. – 730 p.

Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии

ГЛОССАРИЙ ТЕРМИНОВ ПО ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ

А Авторадиограмма — фотографический отпечаток, фиксирующий расположение фракций ДНК, полученных в результате электрофореза и гибридизовавшихся с радиоактивно меченым зондом. Получают путем наложения чувствительной к радиоактивному излучению фотопленки на нитроцеллюлозную мембрану, полученную после Саузерн-блот гибридизации (см.).

Антикодон — группа из трёх оснований, занимающая фиксированное положение в транспортной РНК (см. Транспортная РНК), которая комплементарна кодону (см.) в информационной (матричной) РНК (см.

Информационная (матричная) РНК).

Б Бактериофаг — вирус, поражающий определенный тип бактерий. Общее название вирусов, инфицирующих бактерии – фаги (бактериофаги).

Бактериофаг, фаг — умеренный бактериофаг, инфицирующий E. coli (см.). Его геном представляет собой линейную двунитчатую ДНК размером в 49 кб, упакованную в белковую оболочку. На каждом 5'-конце ДНК имеются одноцепочечные комплементарные участки (см. Сos-сайты) длиной в 12 нуклеотидов (см. Липкие концы, Космиды), что позволяет ей образовывать кольцевые структуры после попадания в клетку-хозяина. Фаг обладает способностью к умеренной инфекции, т. е. кроме разрушения клетки он может встраивать свою ДНК в хромосому бактериальной клетки и длительное время реплицироваться синхронно с ДНК хозяйской клетки.

Банк генов (gene bank) — набор генов данного организма, полученный на основе рекомбинантных ДНК (см. Геномная библиотека, Библиотека генов).

Библиотека генов (gene library) — коллекция произвольно клонированных фрагментов геномной ДНК организма (см. Геномная библиотека, Банк генов) или специальный набор фрагментов ДНК, представляющих, напр., коллекцию иРНК (см. РНК информационная, кДНК), экспрессирующуюся в клетке в определенное время. В таких библиотеках фрагменты инсерцируются (включаются) в подходящие вектора, напр, космидные (см. Космида) или бактериальные векторы, и трансформируются (см. Трансформация) в подходящего хозяина. В идеале геномная библиотека должна содержать практически весь геном вида, из которого она происходит, а библиотека кДНК Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 15 — все различные молекулы иРНК данной клетки на одной и той же стадии развития. Сейчас сконструировано множество типов генных библиотек для различных целей исследования.

Блоттинг (blotting – промакание) — этап процесса Саузерн-блот гибридизации, в результате которой весь электрофоретический спектр ДНК отпечатывается (blotting) за счет капиллярных сил на приложенной к гелю нитроцеллюлозной мембране (пленке), после чего фиксируется при помощи высокой температуры.

В Вектор, переносчик — молекула ДНК, способная самостоятельно реплицироваться в клетках различных организмов, включать в себя чужеродную ДНК и обеспечивать размножение (клонирование) и работу (экспрессию) встроенного в неё искусственно какого-либо гена. Является инструментом генной инженерии, обеспечивающим доставку (перенос) генетической информации в клетку-реципиент и ее клонирование (см.).

вектор — вектор сконструированный на базе фага (см.), использующийся при клонировании достаточно больших фрагментов чужеродной ДНК длиной около 15 кб.

Величина генома (genome size) — количество пар оснований (п. о.) в расчете на гаплоидный геном (см. Гаплоидный набор).

Вирусы — формы внеклеточной жизни, которые состоят из ДНК (ДНКвирусы: аденовирусы, бакуловирусы, геминивирусы и др.) или РНК (РНКвирусы: бромовирусы, ретровирусы и др.) и белковой оболочки. В. не содержат клеточных органелл и используют для репликации метаболизм клетки хозяина. Клетка хозяина может быть разрушена в процессе репликации, и В. освобождается из клетки. В., патогенные для бактерий называют бактериофагами (см.).

Вирус sv-40, вирус обезьян — полиомавирус, геном которого состоит из кольцевой двунитчатой молекулы ДНК размером в 5,2 кб, содержащей 5 генов. Впервые был обнаружен у зеленой африканской обезьяны (зеленой мартышки) Cercopithecus aethiops. Инфицирует культивируемые клетки приматов, исключая человека. Размножение В. о. приводит к образованию до 100 000 вирусных частиц в одной клетке — это его свойство позволяет использовать вирусную ДНК в качестве эффективного вектора в генной инженерии.

Вырожденность кода — в молекулярной биологии генетический код (см.) является вырожденным, поскольку одна аминокислота кодируется более чем одним нуклеотидным триплетом, кодоном (см.). Напр., тирозин кодируется двумя триплетами УАУ и УАЦ, а лейцин может кодироваться даже шестью.

Г

-галактозидаза (-galactosidase) — фермент, который катализирует расщепление лактозы на глюкозу и галактозу. У Е. coli.-г. является тетрамером, Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии кодируемым 1ас-Z-геном, размером 5000 Д..-г. относится к группе адаптивных ферментов, т. е. его синтез возможен только при наличии субстрата (лактозы) во внешней среде.

Гель — желеобразный матрикс, состоящий из полимерного компонента и буферного раствора, используется для разделения в процессе электрофореза макромолекул ДНК (агарозный Г.), РНК (агарозный, полиакриламидный Г.) или белков (полиакриламидный или крахмальный, Г.).

Ген — основная физическая и функциональная единица наследственности, несущая информацию от одного поколения к другому. Г. представляет собой специфическую последовательность нуклеотидов в ДНК, а у некоторых вирусов — в РНК, детерминирующих или нуклеотидную последовательность транспортных РНК (тДНК), или рибосомных РНК (рДНК), или последовательность аминокислот в белках. Как правило, Г. состоят из кодирующих (экзоны) и некодирующих (интроны) последовательностей.

Интронные последовательности чаще всего встречаются у эукариот. Любой Г., занимает строго определенное место, или локус, в хромосоме и может мутировать в различные аллельные состояния, а также рекомбинировать с гомологичными генами. Действие Г. проявляется в фенотипе. По выполняемым функциям Г. подразделяют на 3 класса: а) структурные Г., которые транскрибируются (см. Транскрипция) на ДНК, а затем транслируются на рибосомах (см. Трансляция) в полипептидные цепочки; б) структурные Г., которые транскрибируются в рРНК или тРНК и сами непосредственно используются; в) регуляторные Г., которые транскрибируются, но служат сайтами узнавания (см.) для ферментов и др.

белков при репликации и транскрипции ДНК. Термин введен В. Иогансеном в 1909 г. и нередко заменяется понятиями "наследственный фактор".

Ген устойчивости — ген, кодирующий белок, который катализирует разрушение токсина. Г. у. часто используются в векторах клонирования (см.) для облегчения отбора трансформантов (напр., ген антибиотикоустойчивости и др.).

Генетическая инженерия, генная и. — 1. Наука о генетическом конструировании, направленном создании новых форм биологически активных ДНК и генетически новых форм клеток и целых организмов с помощью искусственных приемов переноса генов (технологии рекомбинантных ДНК, генетической трансформации, гибридизации клеток). 2.

Экспериментальные разделы молекулярной и клеточной биологии, которые позволяют in vitro изменять структуру генов, создавать новые гены или конструировать химерные гены (см. рекомбинантная ДНК). Г. и. возникла в 1972 г., когда впервые П. Берг создал рекомбинантную ДНК, включавшую в себя фрагменты фага-, Е. соli и вируса обезьян sv40 (см.).

(genetic transformation) — см.

Генетическая трансформация Трансформация.

Генетические карты — карты линейного расположения генов на хромосоме Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 17 (группы сцепления), выявленные в экспериментах по генетическим рекомбинациям, а также распределение генов по разным хромосомам, как правило, с указанием генетического расстояния между ними.

Генетический код — система записи наследственной информации в молекулах нуклеиновых кислот (см.), основанная на определенном чередовании последовательностей нуклеотидов в ДНК или РНК, образующих кодоны (см.) соответствующих аминокислот белков. Каждый кодон кодирует одну молекулу аминокислоты. Г. к. триплетен (см. Триплет) — 3 нуклеотида кодируют 1 аминокислоту. Последовательности нуклеотидов в иРНК (см. РНК информационная) обозначены от 5' до 3', т. е. слева направо, т. к. имеется определенная направленность трансляции (см.). Код называют вырожденным (см. Вырожденность кода), если аминокислота определяется не одним, а большим числом кодонов. Код читается с фиксированной точки старта, в одном направлении, по 3 последовательно следующих друг за другом нуклеотида (триплета). Г. к. универсален для всех живых организмов.

— точная идентификация (дактилоскопия) Генная дактилоскопия личности на основе молекулярно-генетического анализа индивидуальных образцов ДНК (см. ДНК-фингерпритинг, Фингерпринт ДНК).

Геном (genom) — совокупность генов, характерных для гаплоидного набора хромосом данного вида организмов. Основной гаплоидный набор хромосом.

Геномная библиотека (genomic library) — набор клонированных (см.

Клонирование) фрагментов ДНК, представляющих индивидуальный (видовой) геном (см. Библиотека генов, Банк генов). У млекопитающих (в т. ч. у человека) геномы крупные, поэтому для них обычно создают хромосомные библиотеки (см.).

Гекомная ДНК (geitomic DNA) — 1. Вся хромосомная ДНК организма; 2.

Ядерная ДНК в клетках эукариот (см. Дезоксирибонуклеиновая кислота).

Гибридная (рекомбинантная) ДНК — новая последовательность ДНК, образованная in vitro путем лигирования (см.) двух или более негомологичных молекул ДНК. Напр., рекомбинантная плазмида (см.), содержащая одну или более вставок чужеродной ДНК, которые включены в сайт клонирования или в полилинкер. Организмы, содержащие такие in vitro сконструированные ДНК, также относятся к рекомбинантам (рекомбинантный фаг, бактерия). Рек. ДНК широко используется в генетической инженерии in vitro.

Д Двухцепочечная молекула кДНК — см. кДНК, комплементарная ДНК.

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) — высокомолекулярный полимер, состоящий из четырех дезоксирибонуклеотидов (A, T, Ц, Г), апериодическим чередованием которых кодируется генетическая информация вирусов, бактерий и высших организмов. ДНК может быть однонитчатой (ssДНК), как, напр., у некоторых вирусов, или двунитчатой (dsДНК) у всех высших организмов. У двунитчатой ДНК две комплементарные нити закручены в спираль, одна нить вокруг другой с противоположной Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии ориентацией (антипараллельны, 5' 3' и, наоборот, 3' 5'). Две нити удерживаются вместе водородными связями между комплементарными основаниями (А = Т; Г = Ц). ДНК способна к самоудвоению, что обеспечивает генетическую преемственность между поколениями в процессе размножения.

Нарушение последовательностей нуклеотидов в цепи ДНК приводит к наследственным изменениям — мутациям.

Денатурация ДНК — представляет собой процесс разъединения двойной спирали нуклеиновых кислот на комплементарные одноцепочечные нити под действием физических и химических факторов (температуры, давления, pH и др.).

ДНК-ДНК гибридизация (DNA-DNA hybridization) — процесс образования двухцепочечной ДНК из двух комплементарных однонитчатых молекул ДНК.

ДНК-лигаза — фермент, который катализирует образование фосфодиэфирных связей между соседними нуклеотидами в молекуле ДНК.

Связи образуются между С—С, С—S, С—О и С—N за счет энергии сопряженной реакции гидролиза. В технологии рекомбинантной ДНК используются в основном две ДНК-л., выделенные из Е. coli и Т4. ДНК-л.

соединяет две молекулы ДНК путем лигирования (см.) тупых или липких концов. Впервые была выделена Б. Вейсом и К. Ричардсоном в 1966 г.

ДНК-зонд (проба) — определенная (известная) радиоактивно- и нерадиоактивно меченая последовательность нуклеиновой кислоты, используемая в молекулярном клонировании для идентификации специфических молекул ДНК, имеющих комплементарные последовательности. Для этого используется радиоавтография или к.-л. др. система детекции (обнаружения) нерадиоактивно меченого зонда.

ДНК-полимеразы (DNA-polymerases) — ферменты, участвующие в синтезе ДНК. У Е. coli были выделены 3 типа ДНК-п.: pol I, pol II и pol III. Pol III является основным ферментом, ответственным за репликацию (см.) ДНК в клетке бактерий. Два др. фермента функционируют преимущественно при восстановлении (репарации) ДНК. Эукариоты содержат множество видов ДНК-п., находящихся в разных частях клетки: в ядре, цитоплазме или митохондриях, и выполняют различные функции, такие, как репликация.

репарация и рекомбинация.

ДНК-фингерпринтинг, метод (техника) создания фингерпринта (DNA fingerprinting or DNA fingerprint technique) — (см. Фингерпринт ДНК), для чего геномная ДНК рестриктируется эндонуклеазами (см.), образующиеся фрагменты разделяются при помощи гелевого электрофореза (см.), переносятся на мембраны (нитроцеллюлозные фильтры, см.) и гибридизуются с мечеными зондами (с.м.) для фингерпринта (ДНК фага М13, различные синтетические олигонуклеотиды, кДНК; геномные зонды, содержащие последовательности генов; мини- и микросателлиты ДНК). В случае наличия в исследуемой ДНК участков, гомологичных зондам, образуются полиморфные Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 19 полосы гибридизации, как правило, специфичные для каждого образца ДНК.

Поэтому метод может быть использован для генетической идентификации (дактилоскопии) индивидуумов одного вида. Применяется при картировании геномов, выяснении отцовства, в криминалистике.

Е Escherichia соli, E. coli, кишечная палочка — грамотрицательная кишечная бактерия, широко известная в молекулярной биологии. Её геном (хромосома) включает ок. 4500 кб ДНК, организованных в 50 независимых топологических доменов, и содержит серию инсерций. В н. вр. практически весь геном секвенирован и более 1000 генов картированы. E. coli имеет большое значение для экспериментальных исследований рекомбинантной ДНК (см.), т. к. она служит хозяином для большого числа разных вирусов, плазмид и космидного клонирования векторов (см. Вектор клонирования. Космида).

EcoRI — одна из широко применяемых рестрикционных эндонуклеаз, или рестриктаз (см.), извлекаемая из Escherichia соli, которая в двухцепочечной ДНК узнает последовательность из шести нуклеотидов ГААТТЦ и разрезает ее между Г и А, образуя липкие концы (см.). В н. вр. выделено 7 рестриктаз группы EcoR — от EcoRI до EcoRVII.

И Информационная (матричная) РНК (и-РНК, мРНК) — форма РНК, осуществляющая передачу записанной в ДНК информации к местам синтеза белка, состоит из одной цепи, содержит от одной до десяти тысяч пар оснований.

Интроны, интрогенные районы (introns or intragenic regions or intervening sequences) — последовательности нуклеотидов у эукариотических генов, транскрибируемых в про-иРНК, которые затем вырезаются и деградируют в ядре.

Остающиеся последовательности транскрипта (см. Экзоны) соединяются, образуя зрелую информационную РНК (см.), с которой осуществляется трансляция белка.

Т. обр., И. никогда не присутствуют в белке. И. различаются по длине (от 50 до 12000 нуклеотидов), по их числу на один ген (один и более) и по последовательности нуклеотидов. Однако в большинстве И. пограничные сайты между И. и экзоном идентичны. Эти пограничные участки обеспечивают правильное вырезание (эксцизию, см.) И. и сплайсинг экзонов.

Искусственные генетические структуры — целенаправленно сконструированные (созданные) новые формы биологически активных ДНК и генетически новые формы клеток с помощью искусственных приёмов переноса фрагментов ДНК, целых генов или их частей.

In vitro (лат.), "в пробирке" — биологические процессы, смоделированные при их экспериментальном изучении в условиях изоляции от всего (целого) организма, т. е. "в пробирке", напр., культура ткани, фермент-субстратная реакция и т.д.

К Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии Картирование (mapping) — установление позиций генов или каких-то определенных сайтов (см.) вдоль нити ДНК (см. Генетические карты, Рестрикционные карты).

Картирование генов (gene mapping) — установление линейной организации генов, определение относительной локализации генов на хромосомах (см. Хромосомные карты) или плазмидах (кольцевая карта сцепления) и относительного расстояния между ними. Генетические карты можно создавать на основе анализа рекомбинаций (см.), принятого в классической генетике, или на основе данных молекулярной генетики, т, е. напрямую используя данные сиквенса ДНК (см. Сиквенирование ДНК).

Кб, килобаза (kb, kilobase) — единица, используемая для выражения размера нуклеиновых кислот (см.), 1 кб = 1000 нуклеотидов, или пар оснований (п.

о.), в двухцепочечной ДНК.

кДНК, комплементарная ДНК (cDNA, complementary DNA) — одно- или двунитчатая молекула ДНК, комплементарная молекуле иРНК. Образуется при обратной транскрипции иРНК с помощью обратной транскриптазы (см.) in vitro.

кДНК соответствует определенному гену без интронов.

Кишечная палочка — см. Escherichia соli.

Клонирование (cloning or molecular с.) — получение клонов (см.) с помощью одного или многих методических приемов. Различают клонирование генов — выделение и амплификация отдельных генов в реципиентных клетках, а также молекулярное клонирование — размножение молекул ДНК в составе вектора.

Клонирование гена (gene cloning) — см. Клонирование Клонирование ДНК (DNA cloning) — использование технологии рекомбинантной ДНК для инсерции (включения) фрагмента ДНК, напр, гена, в клонирующий вектор (см.) и размножение этой последовательности путем трансформации вектора в подходящую клетку-хозяина, напр, в клетки кишечной палочки.

Кодон — последовательность из трех соседних нуклеотидов в ДНК или РНК, кодирующая определенную аминокислоту либо начало и конец трансляции (см.), т. е. это дискретная единица генетического кода. Всего возможно 64 сочетания нуклеотидов в триплетах — 61 из них кодирует 20 аминокислот, а 3 являются нонсенс-кодонами (см. Стоп-кодон).

Кольцевые молекулы ДНК — см. плазмиды (кольцевые).

3'-Конец (3'-carbon atom end or З'-terminus) — один из концов линейной молекулы ДНК или РНК, несущий нуклеотид со свободной гидроксильной группой (ОН-) у 3’-атома углерода рибозы или дезоксирибозы.

5'-Конец (5'-carbon atom end or 3'-terminus) — один из концов линейной молекулы ДНК или РНК, несущий нуклеотид со свободной гидроксильной (ОН-) группой у 5'-атома углерода рибозы или дезоксирибозы. С 5'-конца начинается синтез полинуклеотидных цепей в процессе репликации (см.), транскрипции (см.) и репарации (см.).

Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 21 Конкатамер ДНК (DNA concatemer) — структура из нескольких повторяющихся (одна за другой) единиц гена. У некоторых фагов (напр., фаг и Т4) геном во время репликации представлен в виде конкатамерных молекул — больших молекул ДНК, образованных из нескольких тандемно повторяющихся единиц генома.

Конструирование гибридных молекул ДНК — создание новых форм биологически активных ДНК с помощью искусственных приёмов переноса и сшивания различных фрагментов ДНК.

Концевая (терминальная) трансфераза (terminal transferase) — фермент, катализирующий достройку 10-40 дезоксинуклеотид-5'-трифосфатов к 3'-ОНгруппам обоих концов двунитчатой ДНК или к однонитчатой ДНК, образуя 3'гомополимерное удлинение нити (полидезоксиаденилат) и освобождая неорганический пирофосфат. Фермент используется для радиоактивного мечения молекулы ДНК и образования гомополимерных хвостов на 3'-концах ДНК. Т. т.

широко используется в технологиях рекомбинантной ДНК (см.).

Космиды — векторная плазмида, содержащая cos-участок (cos-сайт) ДНК фага лямбда, являющийся местом замыкания его линейной формы в кольцо.

Благодаря наличию cos-участка К., включающая чужеродные гены, может быть упакована в головку фага in vitro. Метод клонирования ДНК с использованием К. разработан Дж. Коллинзом и Б. Холманом в 1977 г.

Л lac-Z-ген (lac-Z-gene) — ген лактозного оперона Е. coli, кодирующего галактозидазу. Этот фермент катализирует превращение дисахаридов лактозы в моносахариды и глюкозу. lac-Z-ген входит в состав различных клонирующих векторов и выполняет роль репортерного гена (см.) в экспериментах по трансформации.

Лигаза, синтетаза — см. ДНК-лигаза.

Лигирование (ligalion) — 1. Процесс ковалентного соединения двух линейных молекул нуклеиновых кислот посредством фосфодиэфирных связей, осуществляемый с участием фермента лигазы. 2. Прием в генетической инженерии, в ходе которого чужеродная ДНК встраивается между двумя концами плазмидной ДНК с помощью фермента лигазы (см.).

Лизирование, лизис (lysis) — разрушение растворение вирусами, клеток хозяина под действием ферментов, содержащихся в лизосомах и выделяемых инфицирующими вирусными частицами, в результате чего в среду высвобождается новое потомство вируса.

Лизогения (lysogeny or lisogenicity) — состояние бактериальной клетки, при котором в ее хромосоме находится один или несколько встроившихся умеренных бактериофагов (профагов) и при этом не инициируется синтез фагового материала, а профаги репродуцируются вместе с хромосомами хозяина, передаваясь при каждом клеточном делении в дочерние клетки. При Л.

бактериофаг сохраняет способность выходить из генома клетки-хозяина.

Линкер, линкерная ДНК (linker, l. DNA) — Синтетический Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии олигодезоксирибонуклеотид определенной последовательности, содержащий один или несколько сайтов узнавания (см.) для рестрикционных эндонуклеаз (см.). Л. может быть лигирован к любому тупому концу (см.) дуплексной ДНК с помощью Т4ДНК-лигазы (см.).

Липкий конец — термин, относящийся к двунитчатой молекуле ДНК, у которой одна нить длиннее ("выступающая"), чем другая ("заглубленная").

Выступающий участок нити может спариваться с др., комплементарным ему выступающим (липким) концом. Пример: два коротких (12 нуклеотидов) однонитчатых 5'-выступов на каждом конце линейного генома фага лямбда (cos-сайт). Эти Л. к. комплементарны по последовательностям нуклеотидов друг другу и могут спариваться, образуя кольцевую ДНК.

М Маркер для селекции (селективный маркер) — специальный ген, кодирующий устойчивость к к.-л. антибиотику (напр., канамицину), который вводят в вектор для последующего отбора трансформантов.

Минисателлиты (minisatelliles) — короткие (9-64 н.п.), среднеповторяющиеся, тандемно организованные, высоко-вариабельные последовательности ДНК (обычно богатые ГЦ-последовательностями), рассредоточенные по геному человека (встречаются также у растений и животных). Они имеют одну общую короткую последовательность в 10-35 н.п.

М.-с. проявляют значительный полиморфизм по длине, который возникает в результате неравного кроссинговера). В итоге в М.-с. изменяется число коротких тандемных повторов (см.), что ведет к образованию последовательностей длиной от 0,1 до 20 кб. Короткий тандемно повторяющийся М.-с., являясь хорошим генетическим маркером для анализа сцепления (см. ДНК-фингерпринтинг), может использоваться в качестве гибридизационного зонда для одновременного обнаружения высокополиморфных М.-с. в пределах рестриктов ДНК. Вероятность идентичности того же набора фрагментов ДНК у двух человек теоретически настолько мала, что каждый человек считается уникальным по набору полос (за исключением однояйцевых близнецов, см.), выявляющихся в результате гибридизации на радиоавтографах.

Молекула ДНК — см. Дезоксирибонуклеиновая кислота.

Молекулярная биология — область биологии, исследующая проявление жизни на молекулярном уровне. Основное направление М. б. — выяснение роли биологически важных молекул (белков, нуклеиновых кислот и др.) в росте и развитии организмов, хранении и передаче наследственной информации, превращении энергии в живых клетках и т. п. явлениях. М. б.

включает в себя молекулярную генетику, молекулярную вирусологию, молекулярную иммунологию и т. д. М. б. сформировалась в середине XX в. и бурно развивается в наши дни.

Молекулярная генетика — раздел современной генетики, изучающий Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 23 закономерности и молекулярные механизмы хранения, воспроизведения и передачи наследственных признаков.

Н Наследственно измененные организмы — см. Трансгенные организмы.

Трансформированные организмы.

Нитроцеллюлозная (пленка) мембрана — состоит из нитроцеллюлозных нитей, образующих поры определенного размера (0,45м). Селективно (выборочно) улавливают двунитчатую ДНК или ДНК-РНК-гибриды, но свободно пропускают однонитчатые молекулы. Однонитчатые ДНК и РНК также могут задерживаться на Н. м., если ее проинкубировать при 80 °С в течение 2 ч (спекание). Такие блоты (пленки) используются в Саузерн- и Нозерн-блот экспериментах.

Нуклеотиды — органические вещества, состоящие из пуринового или пиримидинового основания, сахара рибозы (дезоксирибозы) и фосфорной кислоты; составная часть нуклеиновых кислот и многих коферментов (НАД,

НАДФ, кофермента А и др.). Н. также называют нуклеозидфосфатами:

аденозинмонофосфат (АМФ), гуанозинмонофосфат (ГМФ), цитидинмонофосфат (ЦМФ), уридинмонофосфат (УМФ) и тимидинмонофосфат (ТМФ). Н. являются некоторые макроэргические соединения, напр. АТФ.

О Обратная транскриптаза, РНК-зависимая ДНК-полимераза, ревертаза (reverse transcriptase, RNA-dependent DNA-polymerase) — ретровирусный многофункциональный фермент класса трансфераз, синтезирующий двунитчатую ДНК с использованием в качестве матрицы однонитчатой РНК. О. т. широко используются в ДНК-рекомбинантной технологии для синтеза кДНК (см.) с информационной РНК и в генной инженерии для получения нужных ДНК in vitro. У некоторых ретровирусов (см.) О. т. является мономером, у других — димером.

Олиго(dТ) праймер (oligo(dT) primer — синтетический гомополимерный олигодезоксирибонуклеотид, который может быть подсоединен к поли(А)хвосту (см.) полиаденилированной иРНК и использоваться как праймер (см.) для синтеза первой нити кДНК с помощью обратной транскриптазы.

П Первая рекомбинантная (гибридная) молекула ДНК — создана в 1972 г.

П. Бергом, которая включала в себя фрагменты фага, Е. соli и вируса обезьян sv-40.

Плазмиды — внехромосомный (экстрахромосомный) генетический элемент, кольцевая, автономно реплицирующаяся дуплексная молекула ДНК, имеющая размеры от 1 до 200 и более кб и от одной до нескольких сот копий на бактериальную клетку. Число копий П. может зависеть от факторов среды. П.

обычно придают селективные преимущества клетке хозяина (напр., устойчивость к антибиотикам). Конъюгативные П. имеют набор генов, Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии обеспечивающих их перенос в др. клетки. Бактериальные П. широко используются для конструирования векторов клонирования. Термин «П.»

предложен Дж. Ледербергом и др. в 1952.

Плазмида pBR322 — серия сравнительно небольших, мультикопийных и неконъюгативных плазмидных векторов клонирования, содержащих гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину, а также несколько уникальных сайтов клонирования (или полилинкеры). Сайты клонирования локализованы в пределах одного из генов устойчивости. Это позволяет обнаруживать инсерцированную чужеродную ДНК по исчезновению устойчивости к антибиотику на селективной среде. Плазмида синтезирована в 1977 г.

мексиканскими исследователями Боливаром и Родригесом. Они использовали ген тетрациклин-устойчивости от pSC101, ориджин репликации ori и rеp-ген от ColE1, а ген ампициллин-устойчивости — от транспозона Тп 3. Плазмида реплицируется в Е. coli.

Плазмида pSC101 — первая плазмида, которую начали использовать в генной инженерии. Несет только один сайт рестрикции для EcoR1 и превращается под действием этого фермента из кольцевой в линейную молекулу, концы которой могут «слипаться» между собой или с любыми фрагментами другой ДНК, полученными под действием той же рестриктазы.

Обладает геном устойчивости к антибиотику тетрациклину и поэтому легко обнаруживается в бактериях на среде с этим антибиотиком. Все эти свойства pSC101 и были использованы для создания и клонирования первых гибридных (рекомбинантных) ДНК (см.).

— один из серии относительно мелких Е. coli Плазмида pUC18 плазмидных векторов клонирования (см.), содержащий PvuII / EcoR-фрагмент из pBR322 (см.) с ampr геном, кодирующим ампинициллин-устойчивость, ориджином репликации ori (см.) и последовательностями, кодирующими -пептид lac-Zгена (-галактозидазы) с полилинкером (см.). Инсерция чужеродной ДНК в полилинкер приводит к нарушению -галактозидазного гена. В этом случае хозяйская бактериальная клетка образует бесцветные колонии, если она растет на среде с ампициллином и субстратом X-gal, который должен расщепляться при помощи -галактозидазы. Штаммы, трансформированные плазмидой pUC18 без вставки чужеродной ДНК на той же среде с X-gal, образуют колонии окрашенные в синий цвет. Т. обр., можно легко отбирать рекомбинантные (т. е. с чужеродной ДНК) колонии.

Поли(А), полиаденилат (poly(A) or polyadenylate) — гомополимер, содержащий остатки адениновых нуклеотидов. Практически все мРНК эукариот на своих 3’-концах содержат последовательность поли(А) или поли(А) хвост.

Полилинкер, сайт множественного клонирования (polylinker or multiple cloning site) — синтетический двунитчатый олигонуктлеотид, содержащий много сайтов рестрикции (см.). П. вводят в векторы, чтобы расширить их возможности для клонирования чужеродных ДНК в любом из этих сайтов.

Последовательность узнавания — см. Сайт узнавания.

Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 25 Правило Чаргаффа — правило, гласящее, что в любой двунитчатой молекуле ДНК число адениновых оснований всегда равно числу тиминовых (А = Т), а число гуаниновых — числу цитозиновых (Г = Ц) оснований. Согласно П. Ч.

количество пиримидинов (Т + Ц) равно сумме пуринов (А + Г). П. Ч. открыто в 1950 г. и лежит в основе классической модели ДНК Уотсона—Крика.

Праймер, затравка (primer) — короткий олигонуклеотид ДНК или РНК, комплементарный участку более длинной молекулы ДНК или РНК. К его З'ОН-концу ДНК-полимераза (см.) может добавлять нуклеотиды в растущую цепь ДНК в 5'—3'-направлении. У прокариот РНК-полимераза (см.) катализирует синтез таких РНК-праймерои для репликации ДНК. П. также нужны для РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы, см), In vitro (см.) используются синтетические П. размером до 10 п. о. для реакции полимеризации ДНК с помощью ДНК-полимеразы или обратной транскриптазы, П. нужны для синтеза кДНК, ДНК секвенирования по Сэнгеру (см.), ПЦР и др.

Принцип комплементарности — пространственная взаимодополняемость (взаимное соответствие) поверхностей взаимодействующих молекул или их частей, приводящая, как правило, к образованию вторичных (Ван-дерВальсовых, водородных, ионных) связей между ними. Уникальность и прочность комплементарных структур определяется высокой избирательностью, большой площадью взаимодействия на уровне атомных группировок или зарядов по принципу «ключ - замок» (комплексы антиген – антитело и фермент – субстрат, четвертичная структура белков, вторичная и третичная структура нуклеиновых кислот). Наиб. ярко К. проявилась в структуре двуспиральных ДНК и РНК, где две полинуклеотидные цепи образуют в результате комплементарного взаимодействия пар пуриновых и пиримидиновых оснований (А-Т, Г-Ц) двуспиральную молекулу. Уникальная вторичная и третичная структура одноцепочечных полинуклеотидов (тРНК, рРНК) также определяется комплементарным спариванием оснований с образованием «петель» и «шпилек» вдоль по цепи. К. лежит в основе мн.

явлений биол. специфичности, связанных с «узнаванием» на молекулярном уровне.

Р Радиоактивно меченный ДНКовый зонд — см. ДНКовый зонд.

Разделение рестрикционных фрагментов ДНК — см. Электрофорез в агарозном геле.

Распознаваемые участки — см. Сайты распознавания.

Репликация — процесс точного самовоспроизведения молекул нуклеиновых кислот, сопровождающийся передачей точных копий генетической информации в ряду поколений. Термин Р. в основном используется для определения процесса синтеза новой нити ДНК на матричной нити ДНК с целью точного копирования информации, содержащейся в геноме. Р. ДНК является полуконсервативной.

Основные стадии этого процесса включают Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии разделение нитей ДНК с образованием репликативной вилки, связывание ДНК-полимеразы и добавление комплементарных нуклеотидов начиная с 3'конца. Нить, непрерывно реплицирующаяся (ведущая нить, лидерная нить), должна отделяться от др. (запаздывающей) нити, которая реплицируется прерывисто, короткими кусками (фрагменты Оказаки). После синтеза фрагменты Оказаки лигируются (с участием ДНК-лигазы), образуя целую запаздывающую нить.

Репортерный ген (reporter gene) — ген, хорошо изученный генетически и биохимически, который легко может быть сшит с регуляторной областью др.

генов. Его активность в норме не обнаруживается в организме, в который этот ген переносится. Активность большинства Р. г. можно легко протестировать достаточно простыми методами (напр., определением ферментативной активности

-глюкуронидазы, белкового продукта для галактозидазы, хлорамфениколацетилтрансферазы, люциферазы, неомицин фосфотрансферазы, нопалинсинтазы и др.).

Рестриктазы — ферменты рестрикции, разрезающие ДНК по определенным нуклеотидным последовательностям, называемым сайтами рестрикции (см.).

Р. могут кодироваться не только геномом бактерий, но также плазмидами и бактериофагами. Являются одним из главных инструментов генной инженерии, широко используются для получения рекомбинантных ДНК(см.).

Синоним – рестрикционные эндонуклеазы.

Рестрикционные карты — диаграмма расположения на молекуле ДНК сайтов узнавания (см.) рестриктазами. Самыми полными являются Р. к., построенные для небольших молекул ДНК (напр., хромосом прокариот).

Первую полную физическую карту расположения участков 14 рестриктаз составил Д. Натанс для ДНК вируса sv-40.

Реципиентный организм, реципиент — 1. Любая клетка или организм, получающий: а) новую генетическую информацию в форме чужеродной ДНК или РНК; б) к.-л. биологический материал от др. организма-донора. 2. Клетка, принимающая генетический материал при трансдукции и конъюгации.

Ровные (тупые) концы — термин, относящийся к двухцепочечным фрагментам ДНК у которых ни одна нить на концевых участках не выступает за другую в отличие от липких концов (см.). Р.к. образуются в результате действия рестриктаз (рестрикционных эндонуклеаз) Alu I, Ecor V, Нра I, Nac I, Pvu II, Sma I и др., а также путем удаления однонитчатых концов с помощью S1-нуклеазы или достройки их с помощью ДНК-полимеразы I.

Рибонуклеиновая кислота (РНК) — чаще всего однонитчатый полинуклеотид, характеризующийся наличием в нем сахара рибозы и урацила (вместо дезоксирибозы и тимина в ДНК). Обеспечивает передачу генетической информации (информационная иРНК и транспортная тРНК), служит в качестве структурного каркаса для рибосом (рибосомная рРНК) и выполняет ферментативные функции (рибозимы). Около 90% всей клеточной РНК составляет рРНК, около 8% составляет тРНК, а на долю иРНК приходится Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 27 менее 2%. У эукариот молекулы РНК, как правило, транскрибируются в виде больших молекул (предшественников про-РНК), а затем путем сплайсинга и др. посттранскрипционных модификаций преобразуются в активные (зрелые) формы, имеющие меньшие (иногда существенно) размеры. У про- и эукариот функции РНК сильно различаются. У многих вирусов вся генетическая информация вместо ДНК содержится в одно- и двунитчатых РНК.

Рибосома — органоид клетки, с помощью которого осуществляется биосинтез белка. Р. представляет собой асимметричную рибонуклеопротеидную частицу диаметром 10—20 m, которая состоит из двух субъединиц и обладающая каталитической функцией, ответственной за образование пептидных связей, т. е. за полимеризацию аминокислотных остатков в полипептидную цепь белка. При связывании Р. с информационной РНК начинается синтез полипептидов. Малая субъединица содержит единственную цепь рРНК (16S — у прокариот, хлоропластов и растений, 18S рРНК — у животных), ассоциированную с рибосомным белком (5-белки), которая связывается с иРНК. Крупная субъединица является комплексом единственной большой цепи рРНК (23S рРНК — у прокариот, 25S — у растений и митохондрий, 28S — у животных), одной или двух малых рРНК (5S— у прокариот, 5S и 5,8S— у эукариот) и рибосомных L-белков. Этот комплекс несет сайт для присоединения 2—3 молекул транспортной РНК.

С Сайт клонирования — место (сайт) расщепления ДНК определенной рестриктазой в векторе клонирования, которое локализовано в пределах одного из генов устойчивости. Это позволяет обнаруживать инсерцированную чужеродную ДНК по исчезновению устойчивости к антибиотику на селективной среде в процессе клонирования (см.).

Сайт рестрикции — последовательность пар оснований в молекуле ДНК, в месте расположения которой определенная рестрикционная нуклеаза разрезает (расщепляет) ее.

Сайт узнавания — специфическая последовательность ДНК, с которой связываются рестрикционные эндонуклеазы, а также начинается расщепление молекулы ДНК данным ферментом. Для каждой рестриктазы имеется собственная специфическая последовательность узнавания. Обычно С. у.

представлен коротким палиндромом.

Сos-сайты (cos-sites) — однонитчатые, комплементарные участки на обоих концах ДНК фага лямбда (см. Липкие концы), состоящие из 12 нуклеотидов.

Обеспечивают фагу образование кольцевых структур путем соединения водородными связями комплементарных концов и упаковку ДНК в фаговые частицы. С. cos используются для конструирования космид (см.).

Самостоятельная репликация — способность ряда внехромосомных генетических элементов (плазмид) к автономной репликации.

Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии Саузерн-блот анализ — анализ молекул ДНК и их фрагментов при помощи метода блот-гибридизации по Саузерну.

Саузерн-блот гибридизация — метод, позволяющий идентифицировать конкретные гены и другие рестрикционные фрагменты ДНК после их электрофоретического разделения. Суть метода заключается в том, что сначала фрагменты ДНК, разделенные в агарозном геле, денатурируются до одноцепочечных молекул, а затем весь электрофоретический спектр ДНК отпечатывается (blotting) за счет капиллярных сил на приложенной к гелю нитроцеллюлозной мембране (пленке), после чего фиксируется при помощи высокой температуры. Далее мембрана помещается в гибридизационный буфер, содержащий специальный радиоактивно меченный ДНКовый зонд – короткую специфическую последовательность ДНК. Зонд способен гибридизоваться с определенным комплементарным фрагментом ДНК и свяжется только с одной или несколькими конкретными фракциями из всего электрофоретического спектра полученных рестрикционных фрагментов ДНК.

На последнем этапе к нитроцеллюлозной мембране, содержащей весь спектр полученных фрагментов ДНК, включая фракции гибридизовавшиеся с радиоактивно меченым зондом, прикладывают рентгеновскую пленку. На пленке (авторадиограмме) после экспозиции выявляются засвеченные места, соответствующие расположению меченых фракций ДНК. Метод разработан Э.

Саузерном и Р. Дейвисом в 1975 г.

Светящиеся фракции ДНК — двунитчатые фракции ДНК в агарозном или полиакриламидном геле, окрашенные красителем этидий бромидом, в комплексе с которым приобретают малиновую окраску при УФ освещении.

Сиквенирование ДНК (DNA sequencing) — метод определения последовательности оснований в молекуле ДНК. Существует несколько методов секвенирования: автоматическое, химическое, прямое, секвенирование по Максаму-Гил-берту, Сэнгеру и др.

Сиквенирование ДНК по Максаму-Гилберту, химический метод (МахатGilbert sequencing or chemical s.) — один из наиболее распространенных методов определения первичной последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК, Вначале ДНК режется на фрагменты размером 0,6—2,0 кб, концы фрагментов метятся радиоактивной или нерадиоактивной меткой и плавятся для получения однонитчатых молекул. Радиоактивное мечение может осуществляться изотопами серы 35S или фосфора 32Р, нерадиоактивное мечение — с помощью биотиновой или флуоресцентной метки. После мечения образец ДНК разделяется на 4 части, каждую из которых обрабатывают реагентом, специфически разрушающим одно из четырех оснований ДНК.

Условия реакции подбирают таким образом, чтобы на каждую молекулу ДНК приходилось лишь несколько повреждений. Когда эти повреждённые молекулы обрабатывают пиперидином, в ДНК образуется разрыв в том месте, где находилось разрушенное основание. В результате получается набор 5'меченых меченых фрагментов, длины которых определяются расстоянием от Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 29 разрушенного основания до конца молекулы. Фрагменты, полученные в результате 4 типов реакции, подвергаются электрофорезу (см.) в полиакриламидном геле, и затем полосы выявляются соответствующим методом в зависимости от способа мечения. На основе результатов электрофореза определяются нуклеотиды и их последовательность в исходной ДНК.

Сиквенирование ДНК по Сэнгеру, ферментативный метод (Senger sequencing or enzymatic method s.) — техника сиквенирования (см.) однонитчатой ДНК. В основе метода — присоединение к однонитчатой ДНКматрицы секвенирующего праймера (см.) (обычно синтетических олигонуклеотидов). Реакционная смесь переносится в 4 пробирки, куда добавляются все 4 дезоксинуклеозидтрифосфата, один из которых мечен по Р. Каждая пробирка содержит тпекже различные дидезоксинуклеозидтрифосфаты (ддАТФ, ддЦТФ, ддГТФ и ддТТФ). Для синтеза комплементарной цепи к однонитчатой последовательности-матрицы в пробирки добавляется фермент ДНК-полимераза(см.). В результате происходит удлинение праймера в соответствии с матричной последовательностью. Когда в растущую цепь вместо соответствующего дНТФ в матрице включается ддНТФ, 3'-конец растущей цепи теряет гидроксильную группу и не может дальше удлиняться: цепь терминируется. В итоге каждая реакционная смесь получит набор радиоактивно меченных фрагментов ДНК с общим 5'-концом (праймер), но с разными 3'-концами. После окончания реакции ДНК денатурируется, затем подвергается электрофорезу в полиакриламидном геле (см. Секвенирующий гель) и с помощью радиоавтографии (см.) выявляются радиоактивные полосы. Последовательность нуклеотидов в исходной ДНК-матрице может затем прочитываться прямо с радиоавтограммы.

Скрининг — поиск в генной библиотеке клонов конкретной колонии, содержащей нужный фрагмент чужеродной ДНК.

Создание рекомбинантных ДНК — конструирование новых последовательностей ДНК, образованных in vitro путем сшивания двух или более негомологичных молекул ДНК. Первая рекомбинантная ДНК была создана (сконструирована) в 1972 г. П. Бергом и включала в себя фрагменты фага, Е. соli и вируса обезьян sv40 (см. Первая рекомбинантная (гибридная) молекула ДНК).

Стоп-кодон, нонсенс-к., терминатор — тринуклеотид в информационной РНК, сигнализирующий об окончании синтеза полипептида и освобождении полной полилептидной цепи от рибосомы (см.). Существует три различных типа данных С.-к.: УАГ (амбер), УГА (опал) и УАА (охра). Ни один из них не соответствует антикодону тРНК.

Sma I — одна из рестрикционных эндонуклеаз, или рестриктаз (см.), которая в двухцепочечной ДНК узнает последовательность из шести нуклеотидов ЦЦЦГГГ и разрезает ее между Ц и Г, образуя ровные (тупые) концы (см.).

Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии Т Таблица (словарь) генетических кодов, с. кодонов (genetic code table (dictionary)) — таблица, включающая генетические значения отдельных кодонов (см.), или триплетов (см.), соответственно продуктам их функционирования.

Содержит 64 кодона, из которых 61 смысловой т.е. каждый из них кодирует конкретную аминокислоту и 3 стоп-кодона (см.), или нонсенс-кодона, которые сигнализируют об окончании синтеза полипептида и освобождении полипептидной цепи от рибосомы (см.).

Тандемный повтор (tandem repeat) — Организация двух или более расположенных рядом одинаковых последовательностей в пределах двунитчатой молекулы ДНК. Возможны два типа их ориентации — прямые повторы (голова к хвосту 5' – ЦГААТЦ ГТТАТЦГ ГТТАТЦГ AЦГГТ - 3') или непрямые повторы (голова к голове 5' - ЦГААТЦ ЦТТАТЦГ ГЦТАТТГ АЦЦГТ - 3'). Т. п. в области кодирующих генов могут вести к тандемноповторяюшимся аминокислотным последовательностям.

Транскрипция — синтез молекул РНК на ДНК- или РНК-матрице, осуществляемый ДНК-зависимой или РНК-зависимой РНК-полимеразой. Т. — первый этап реализации генетической информации, записанной в ДНК, осуществляемый с участием фермента РНК-полимераза у прокариот и не менее 3 типов РНК-полимераз, транскрибирующих гены у эукариот.

Трансляция — считывание (декодирование) информационной РНК, рибосомами (см.) и транслирование этого кода в белок. Процесс Т. начинается с того, что 5'-лидирующее окончание иРНК связывается с рибосомой. Затем иРНК движется через рибосому и служит матрицей для встраивания аминокислот в белок. Как только 5'-лидирующий конец иРНК пройдет через первую рибосому, он может связаться с др. рибосомой, на которой вновь будет происходить повторное декодирование и синтез белка (трансляционная амплификация). Как только 3'-поли(А)хвост иРНК выйдет из первой рибосомы, вновь синтезированный белок отделяется, а рибосома может начать следующий цикл Т. Группировка аминокислот в белок, осуществляемая с помощью тРНК, начинается с аминоконца (N-конец) и заканчивается карбоксильным концом (С-конец). На рибосоме имеются два сайта связывания для тРНК: Р- и А-сайты. Р-сайт (пептидил тРНК-сайт) связывает тРНК, которая прикрепляется к концу исходной полипептидной цепи, а А-сайт (аминоацил тРНК-сайт) связывает вновь подходящую тРНК, которая несет следующую аминокислоту. Связывание каждой тРНК с этим сайтом обеспечивает спаривание оснований ее антикодона (см.) с соответствующим кодоном иРНК, движущейся через рибосому. Изменение скорости трансляции иРНК регулирует экспрессию генов.

Транспортная РНК (т-РНК) — низкомолекулярная РНК (содержит 75-90 нуклеотидов), обеспечивающая перенос аминокислот к рибосомам (см.) для включения их в белки. т-РНК имеют специфическую вторичную структуру в виде “листа клевера”, антикодон расположен в антикодоновой петле, а на 5'Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 31 конце всегда находится гуанин (G). Аминокислоты присоединяются к 3'-концу последовательности CCА в тРНК в результате реакции аминоацилирования.

Модель “листа клевера” для вторичной структуры тРНК предложена Р. Холли с сотр. в 1965 г.

Трансформация — 1. Перенос генетической информации в бактериальные клетки при помощи изолированной ДНК с участием или без участия плазмид (см.), но всегда без участия вирусов. 2. Направленная модификация генома клетки с помощью очищенной или рекомбинантной ДНК из клетки др.

генотипа, которая интегрирует (поглощается) в геном модифицируемой клетки. 3. Изменение морфологии клетки или др. ее характеристик (напр., неопластического роста и др.), происходящее после интеграции нуклеиновой кислоты от онкогенных вирусов в клеточный геном, после воздействия химическими канцерогенами или спонтанно (онкогенная Т.). 4. Изменение наследственных свойств клетки в результате проникновения в нее чужеродной ДНК. Впервые обнаружена в 1928 у пневмококков Ф. Гриффитом.

Трансгенные организмы — организмы, в наследственные структуры которых искусственно введён хотя бы один активно функционирующий ген от другого организма.

Трансформированные организмы — организмы с измененными наследственными свойствами в результате проникновения в них чужеродной ДНК.

Триплет — комбинация из трех последовательно расположенных нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты (см. Кодон).

У Участок расщепления — см. Сайт рестрикции.

Участок узнавания — см. Сайт узнавания.

Ф Фаги — см. Бактериофаги.

Ферменты рестрикции — см. Рестриктазы.

Фильтр из нитротцеллюлозной плёнки — см. Нитроцеллюлозная (пленка) мембрана.

Фингерпринт ДНК (DNA fingerprint) — высокоспецифичные гибридизационные полосы на электрофореграммах (фингерпринт), образующиеся как результат полиморфизма длины рестрикционных фрагментов геномной ДНК (ПДРФ, см.). Причиной такого полиморфизма могуг быть мутации в пределах сайта рестрикции (см.), повторы ДНК (мини- и микросателлиты) и др.

Фракции гибридизовавшиеся с радиоактивно меченым зондом — часть молекул ДНК, которые после электрофоретического фракционирования Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии комплементарно связались с радиактивным зондом в процессе Саузерн-блот гибридизации.

Х Х-Gal — специальный субстрат, который расщепляется ферментом галактозидазой (продукт гена lac-Z ) (см.) с образованием нерастворимого осадка сине-голубого цвета. Широко используется в генной инженерии для детекции (выявления) бактериальных колоний содержащих плазмиды со встроенной чужеродной ДНК.

Химерные плазмиды — плазмиды содержащие вставку (фрагмент) чужеродной ДНК.

Хромосомная библиотека (chromosome specific library) — один из видов геномной библиотеки (см.), используемый для анализа геномов больших размеров, напр. человека. X. б. создают клонированием (см.) фрагментов ДНК индивидуальных гомологичных хромосом.

Ч Чужеродная ДНК — ДНК какого-либо организма по отношению к организму-реципиенту.

Э Экзоны (exоns) — последовательности эукариотных генов, которые, как правило, сохраняются при процессинге (см.) про-иРНК и образуют зрелую матричную, или информационную РНК. Э., как правило, чередуются с нитронами (см.). Э.

кодируют три принципиально различные функции: а) функцию лидера:

первый Э. содержит сигналы для инициации транскрипции (см.) и последовательности с функцией, управляющей присоединением матрицы к рибосомам (см.), и не транслируется (см. Трансляция) в белок; б) функции матрицы (информации); Э. содержат информацию, которая обеспечивает образование белка из отдельных аминокислот; в) терминирующие функции (см. Терминация):

последний Э. включает последовательности, которые в зрелой иРНК являются сигналом для окончания трансляции, а также гомополимерное адениловое окончание (хвост) — поли(А) иРНК. Термин экзон предложен У. Гилбертом в 1978 г.

Экспрессия гена — реализация генетической информации, закодированной в ДНК, путем ее транскрипции (см.) и трансляции (см.) иРНК.

Электрофорез в агарозном геле — Метод разделения заряженных биологических макромолекул (белков, нуклеиновых кислот и т. д.) в электрическом поле, базирующийся на их различии по электрическому заряду, форме и размеру. Молекулы мигрируют через инертный агарозный гель под действием электрического поля. Э. открыт Ф. Ф. Рейсом в 1807 г.

В биологии Э. начал использовать А. Тизелиус, сконструировавший первый прибор для электрофоретического разделения белков в 30-е гг. XX в.

Электрофоретическая камера — часть прибора для проведения Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 33 электрофореза. Различают вертикальную и горизонтальную Э.к.

Элонгация (elongation) — удлинение нуклеотидной цепи путем добавления новых нуклеотидов (ДНК- или РНК-синтез) или аминокислотной цепи путем присоединения аминокислот.

Этидиум бромид (3,8-диамино-6-этил-5-фенилфенантридиум бромид) — флуоресцирующий краситель (канцероген), который обладает способностью интеркалировать между парами оснований в двунитчатой ДНК и РНК.

Комплекс нуклеиновой кислоты с Э. б. флуоресцирует под УФ светом.

Используется для визуального обнаружения двунитчатых молекул ДНК в агарозном и полиакриламидном геле (см.) при флуоресцентном излучении в 590 нм. Э. б. позволяет производить количественную оценку содержания нуклеиновых кислот в препарате.

Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии Полимеразная ценная реакция, ПЦР (pofymerase chain reaction, PCR) — процесс амплификации (см.) in vitro, при котором фрагмент ДНК длиной до 15 кб может быть амплифицирован (размножен) до 108 раз (копий). Для этого синтезируются два олигонуклеотида размером в 10-30 нуклеотидов, комплементарных последовательностям на двух концах исследуемой ДНК. Избыточное количество этих двух олигонуклеотидных праймеров (см.; амплимеров) смешивается с геномной ДНК, смесь нагревается для денатурации дуплексов ДНК. При последующем снижении температуры праймеры присоединяются к их геномным гомологам и могут с помощью ДНК-полимеразы удлиниться, т. е. на ДНК-матрице синтезируется вторая цень. Последовательный процесс (цикл процессов) денатурации, отжига праймера и его удлинения повторяется 20-40 раз.

В результате происходит экспоненциальное увеличение копий изучаемой ДНК. За 25 амплификационных циклов количество целевых последовательностей ДНК увеличивается приблизительно в 106 раз. Для синтеза новых цепей ДНК используются термостабильные ДНК-полимеразы (Therminus aqmticus или Taqпoлимераза, Рfu-ДНК-полимераза, Vent™-ДНК-полимераза). В н. вр. ПЦР нашла широкое распространение в молекулярной биологии и на ее основе разработано множество методов анализа геномов. Имеет место также инвертированная полимеразная цепная реакция, т. е, модификация обычной ПЦР, позволяющая амплифицировать неизвестные последовательности ДНК, прилежащие к коровой области известной последовательности.

Полимеразная цепная реакция с произвольными принтерами (arbitrarily primedроlymerase chain reaction, AP-PCR) — модификация стандартного метода ПЦР, позволяющая осуществлять амплификацию (см.) целевых последовательностей ДНК с помощью произвольно взятых праймеров (см.), без предварительного знания нукле-отидных последовательностей данного ге-нома.

Метод позволяет выявлять полиморфизм между штаммами бактерий и грибов, различными сортами растений.

Тag-полимераза, ДНК-п. (Tag polymerase of Tag DNA p. or Thermits aqmiicus DNAp). — cм. Thermus aquaticus ДНК-полимераза.

Thermus aguaticus ДНК-полимераза (Thermus aguaticus DNA polymerase) — фермент из термофильной эубактерии Thermus aquaticus (штамм YT1 или BM), осуществляющий полимеризацию дезоксинукле-отидов и не проявляющий или почти не проявляющий З'-5'- и 5'-З'-экзонукле-азной активности (см.

Экзонуклеаза). Фермент исключительно термостабилен (оптимум температуры 70-75 °С) и обеспечивает выборочную амплификацию (см.) любой клонированной ДНК до 10 млн. раз с высокой точностью методом т. н. поли-меразной цепной реакции (см.; ПЦР). Может использоваться для мечения фрагментов ДНК с помощью радиоактивных нуклеотидов, а также биотина (см.) или дигоксигенина.

Отжиг (annealing) — процесс восстановления (ренатурация), называемый также гибридизацией, нуклеиновой кислоты, во время которого одноцепочечные полинуклеотиды образуют двухцепочечную молекулу с водородной связью между комплементарными нуклеотидами двух цепей. О. может происходить между комплементарными цепочками ДНК или РНК, в результате образуются гибридные двухцепочечные молекулы. Название обусловлено тем, что процесс О. связан с первоначальным нагреванием образца и последующим его охлаждением.

Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 35 Бластомера (blastomere) — дробящиеся клетки, образующиеся при митотических делениях яйцеклетки, которые обладают потенциями, реализуемыми в процессе развития. Чтобы подчеркнуть различия в размерах Б., пользуются терминами "макромера" и "микромера''. Б, не растут, поэтому уменьшаются В размерах при последовательных делениях.

Бластула (blastula or vesicular germ or bladder germ) — зародыш многоклеточных животных, образующийся в процессе последовательных дроблений яйца, от типа которых зависит строение Б. Общность структур Б. у всех типов многоклеточных животных подтверждает единство их происхождения.

Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии

ЗАНЯТИЕ 1

ТЕМА: основы молекулярной генетики ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Ознакомиться с составом ДНК и РНК, процессами репликации, транскрипции и трансляции на примере решения типовых задач

1. Теоретическая часть Молекулярная генетика исследует процессы, связанные с наследственностью на молекулярном уровне. Единицей генетической или наследственной информации является ген. Ген – это участок молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), несущей информацию об одной полипептидной цепи.

Молекула ДНК – полимер, состоящий из двух цепочек нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, моносахарида дезоксиорибозы и остатка фосфорной кислоты. Азотистые основания в ДНК бывают четырёх типов: аденин (А), тимин (Т), гуанин (Г) и цитозин (Ц). Вдоль нити ДНК азотистые основания прочно связаны между собой через моносахарид и остаток фосфорной кислоты, между цепочками – через водородные связи. В общей схеме ДНК напоминает лестницу.

Вся «лестница» ДНК закручена в спираль. Между двумя цепочками азотистые основания располагаются закономерно: аденин всегда против тимина, гуанин – против цитозина. Иными словами, аденин комплементарен тимину, гуанин – цитозину.

Молекулы ДНК обладают способностью к удвоению (репликации). В основе процесса удвоения лежит принцип комплементарности.

Количественное соотношение нуклеотидов в молекуле ДНК известны в виде правил

Чаргаффа:

1. А = Т или А / Т = 1

2. Г = Ц или Г / Ц = 1 3. (А + Г) = (Т + Ц) или (А + Г) / (Т + Ц) = 1

4. Количество комплементарных оснований А + Т и Г + Ц у разных видов живых организмов различно. Отношение (Г + Ц) / (А + Т) является важнейшей характеристикой ДНК, как показатель спецефичности её нуклеотидного состава.

Коэффициент специфичности у ДНК варьирует от 0,45 до 2,57 у микроорганизмов, от 0,58 до 0,94 у высших растений и от 0,54 до 0,81 у животных.

Информация о структуре белков записана и хранится в ДНК в виде определённой последовательности нуклеотидов. Расшифровка кода осуществляется с помощью рибонуклеиновых кислот (РНК). Процесс расшифровки начинается с синтеза информационной РНК (и-РНК). Информационная РНК – полимер, состоящий из одной цепочки нуклеотидов. В состав нуклеотидов также входят азотистые основания, моносахарид рибоза и остаток фосфорной кислоты. Азотистых оснований в РНК также четыре: аденин, урацил (У), гуанин, цитозин.

Информационная РНК по принципу комплементарности снимает информацию с ДНК.

Этот процесс называется транскрипцией (рис 1.).

ДНК Т–Г–Г–Т–А–Т А – Ц – Ц – А – Т –А и-РНК У–Г–Г–У–А–У Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 37

–  –  –

3. Примеры решения задач

3.1. Участок одной из цепей ДНК имеет следующую последовательность нуклеотидов: ГААГЦАТАЦ... Определите последовательность нуклеотидов во второй цепи.

Решение:

Согласно принципу комплементарности (А–Т, Г–Ц) последовательность нуклеотидов во второй цепи ДНК будет следующей:

Г А А Г Ц А Т А Ц - первая цепочка ДНК Ц Т Т Ц Г Т А Т Г - вторая цепочка ДНК.

3.2. Укажите последовательность нуклеотидов участка молекулы иРНК, которая образовалась на участке гена с последовательностью нуклеотидов: ЦТГГЦТТАГЦЦГ...

Решение:

Образование информационной РНК идет по тому же механизму, что и самокопирование ДНК: к цитозину присоединяется гуанин, к гуанину – цитозин, к тимину – аденин, однако к аденину ДНК присоединяется не тимин, а урацил РНК.

Таким образом, для решения задачи достаточно произвести замену нуклеотидов по схеме:

Ц Г, Г Ц, А У, Т А.

В результате получим:

Ц Т Г Г Ц Т Т А Г Ц Ц Г - цепочка ДНК Г А Ц Ц Г А А У Ц Г Г Ц - молекула и-РНК

3.3. Фрагмент молекулы ДНК, кодирующий часть полипептида, имеет следующее строение: АТАГТЦЦААГГА.

Определите последовательность аминокислот в полипептиде.

Решение:

Известна одна цепь ДНК, с которой снимается и-РНК. Строим и-РНК по условиям задачи: УАУЦАГГУУЦЦУ. Разбиваем ее на триплеты: УАУ, ЦАГ, ГУУ, ЦЦУ. По таблице генетического кода (см. табл. 1) последовательно находим для каждого триплета соответствующую аминокислоту и строим участок искомого полипептида: –тирозин – глутамин – валин – пролин –.

Итак:

Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 39 АТА ГТЦ ЦАА ГГА - цепочка ДНК УАУ - ЦАГ- ГУУ - ЦЦУ - триплеты и-РНК Тир - Глн - Вал - Про - полипептид.

3.4. Часть молекулы белка имеет такую последовательность аминокислот: – аланин – тирозин – лейцин – аспарагин –. Какие т-РНК (с какими антикодонами) участвуют в синтезе этого белка?

Решение:

По таблице генетического кода находим кодоны и-РНК: ГЦУ, УАУ,

ЦУУ и ААУ. Антикодоны т-РНК будут комплементарны кодонам и-РНК:

ЦГА, АУА, ГАА и УУА. Таким образом:

ГЦУ, УАУ, ЦУУ, ААУ - кодоны и-РНК ЦГА, АУА, ГАА, УУА - антикодоны т-РНК.

3.5. Как изменится структура белка, если из участка гена – АЦАТТТАААГТЦ удалить второй и 10-й слева нуклеотиды?

Решение:

Первоначально строим и-РНК УГУАААУУУЦАГ, а затем, разбив ее на триплеты, строим участок искомого белка в норме: цистеин – лизин – фенилаланин – глутамин. По условиям задачи из цепи ДНК удаляется второй и десятый (слева) нуклеотиды. Остается ААТТТАААТЦ. По полученному участку строим цепь и-РНК УУАААУУУАГ, вновь разбив ее на триплеты, находим строение участка белка после произошедших изменений в ДНК: лейцин – аспарагин – лейцин.

До замены: АЦА ТТТ ААА ГТЦ - ДНК УГУ - ААА - УУУ - ЦАГ - и-РНК Цис - Лиз - Фен - Глн - белок

–  –  –

3.6. Полипептид состоит из следующих аминокислот: лизин – валин

– серин – глутаминовая кислота.

Определите структуру участка ДНК, кодирующего указанный полипептид.

Решение:

Дана последовательность аминокислот в полипептиде. По этим сведениям нетрудно установить строение и-РНК, которая управляла синтезом данного полипептида. По таблице генетического кода находим структуру триплета для лизина (ААА), валина (ГУУ), серина (УЦУ) и глутаминовой кислоты (ГАА). Подобрав кодирующие триплеты, Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии составляем и-РНК для данного полипептида: АААГ УУУЦУГАА. По цепочке и-РНК можно восстановить участок цепи ДНК, с которой она снималась. Урацил вставал против аденина ДНК, гуанин – против цитозина и т.д.

Следовательно, участок интересующей нас цепи ДНК будет иметь следующее строение:

ТТТЦАААГАЦТТ

Но ДНК состоит из двух цепочек. Зная строение одной цепи, по принципу комплементарности достраиваем вторую. Целиком участок двухцепочечной ДНК, кодирующий данный полипептид, будет иметь следующее строение:

ТТТЦАААГАЦТТ АААГТТТЦТГАА

4. Задачи для самоконтроля

4.1. Фрагмент одной цепи ДНК имеет следующий состав:

– А–А–А–Т–Т–Ц–Ц–Г–Г–Г–. Достройте вторую цепь.

4.2. Одна из цепочек молекулы ДНК имеет такую последовательность нуклеотидов: ТЦГАТТТАЦГ...

Какую последовательность нуклеотидов имеет вторая цепочка той же молекулы?

4.3. Укажите порядок нуклеотидов в цепочке ДНК, образующейся путем самокопирования цепочки: ААТЦГЦТГАТ...

4.4. Напишите последовательность нуклеотидов ДНК дополнительно к следующей: ТАГГЦТААТАГЦ.

4.5. Участок цепи молекулы ДНК имеет такую последовательность нуклеотидов: АТЦАТАГЦЦГ. Какое строение будет иметь двухцепочечный участок молекулы ДНК?

4.6. Одна из цепей ДНК с последовательностью нуклеотидов АТТГЦТЦАА используется в качестве матрицы для синтеза и-РНК.

Какую последовательность нуклеотидов будет иметь и-РНК?

4.7. Выпишите последовательность оснований в и-РНК, образованной на цепи ДНК с такой последовательностью:

ТТЦГАГТАЦЦАТ

4.8. Определите последовательность нуклеотидов участка молекулы и-РНК, которая образовалась на участке гена с последовательностью нуклеотидов: ЦАЦГАТЦЦТТЦТ.

4.9. Фрагмент одной из цепей ДНК имеет следующую последовательность нуклеотидов АААГАТЦАЦТАТТЦТГТТАЦТА.

Напишите строение молекулы и-РНК, образующейся в процессе транскрипции на этом участке молекулы ДНК.

4.10. Образовавшийся участок молекулы и-РНК имеет следующий состав кодонов: ГЦГ-АЦА-УУУ-УЦГ-ЦГУ-АГУ-АГА-АУУ. Определите, Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 41 какие коды ДНК будут кодировать эту и-РНК и в какой последовательности они будут располагаться?

4.11. Определите аминокислотный состав полипептида, который кодируется и-РНК следующего состава: ЦЦУ – ЦЦЦ – ЦЦА – ЦЦГ.

4.12. Участок молекулы и-РНК имеет следующее строение:

АГУАГАУУЦУУУ

В каком порядке расположатся аминокислоты в соответствующем участке белка, синтезируемого на этой РНК как на матрице?

4.13. Участок гена, кодирующего белок, состоит из последовательно расположенных нуклеотидов:

ААЦГАЦТАТЦАЦТАТАЦЦААЦГАА. Определите состав и последовательность аминокислот в полипептидной цепи, закодированной в этом участке гена.

4.14. Участок гена, кодирующего одну из полипептидных цепей гемоглобина состоит из кодов следующего состава: ГАЦЦАТГАА.

Определите состав и последовательность аминокислот в полипептидной цепи.

4.15. В систему для искусственного синтеза белка ввели т-РНК, имеющие антикодоны: ЦГА, УУА, АЦА, ЦЦА. Определите, какие аминокислоты смогут участвовать в биосинтезе белка?

4.16. Фрагмент молекулы адренокортикотропного гормона человека, вырабатываемого передней долей гипофиза, имеет структуру: – серин – тирозин – серин – метионин –. Определите перечень антикодонов в тРНК, участвующих в биосинтезе фрагмента АКТГ.

4.17. Часть молекулы белка имеет такую последовательность аминокислот: – лизин – треонин – глицин – валин – аргинин –. Какие тРНК (с какими антикодонами) участвуют в синтезе этого белка?

4.18. Участок гена имеет следующее строение: ЦГЦТЦААААТЦГ...

Укажите строение соответствующего участка того белка, информация о котором содержится в данном гене. Как отразится на строении белка удаление из гена первого нуклеотида?

4.19. Определите порядок следования друг за другом аминокислот в участке молекулы белка, если известно, что он кодируется такой последовательностью нуклеотидов ДНК: ТГЦГТТТАТГЦГ...

Как изменится ответ, если химическим путем из молекулы ДНК будет удален шестой нуклеотид?

Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии

4.20. Назовите последовательные мономеры участка молекулы белка, который синтезируется на основе информации, “записанной” в молекуле ДНК таким порядком нуклеотидов: ЦЦЦАААААГАТА...

Как отразится на строении белка удаление из молекулы ДНК второго нуклеотида?

4.21. Какая последовательность аминокислот кодируется такой последовательностью нуклеотидов ДНК: АГТГТГААЦЦАГ...

и какой станет последовательность аминокислот, если между третьим и четвертым нуклеотидами вставить тимин?

4.22. С какой последовательности аминокислот начинается белок, если он закодирован такой последовательностью нуклеотидов:

ЦЦЦАТГГЦЦГГТ...

А каким станет начало цепочки аминокислот синтезируемого белка, если под влиянием облучения четвертый нуклеотид окажется выбитым из молекулы ДНК?

4.23. Участок цепи белка вируса табачной мозаики состоит из следующих аминокислот: – серин – глицин – серин – изолейцин – треонин

– пролин – серин –. В результате воздействия на и-РНК азотистой кислотой цитозин РНК превращается в гуанин.

Определите изменения в строении белка вируса после воздействия на и-РНК азотистой кислотой.

4.24. Какими последовательностями нуклеотидов информационной РНК кодируется следующая последовательность аминокислот белка: – треонин – триптофан – тирозин – валин –?

4.25. Используя таблицу генетического кода (см. табл. 1), напишите участок ДНК, в котором закодирована информация о следующей последовательности аминокислот в белке: – аргинин – триптофан – тирозин – гистидин – фенилаланин –.

4.26. Начало цепи одного гистона имеет следующую аминокислотную последовательность: – аланин – аргинин – треонин – лизин –. Какова возможная структура начальных фрагментов и-РНК и двухцепочной ДНК?

4.27. Первые 10 аминокислот в цепи В инсулина: фенилаланин – валин – аспарагиновая кислота – глутамин – гистидин – лейцин – цистеин

– глицин – серин – гистидин –.

Определите структуру участка ДНК, кодирующего эту часть цепи инсулина.

4.28. Начальный участок цепи А инсулина представлен следующими пятью аминокислотами: – глицин – изолейцин – валин – глутамин – глутамин –. Определите структуру участка ДНК, кодирующего эту часть цепи инсулина.

Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 43

4.29. Какой последовательностью нуклеотидов ДНК кодируется участок белка, если он имеет следующее строение: – аргинин – пролин – лейцин – валин – аргинин – ?

5. Литература

1. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика: Пер. с англ.: В 3 т. – М.: Мир, 1988., ил.

2. Кочергин Б.Н., Кочергина Н.А. Задачи по молекулярной биологии и генетике. Мн.: Народная асвета, 1982. – 80 с.

3. Соколовская Б.Х. Сто задач по генетике и молекулярной биологии. – Новосибирск: Наука, 1971.

4. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика: Учеб. пособие. – Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та: Сиб. унив. изд-во, 2002. – 459 с., ил.

5. Картель Н.А. Биоинженерия: методы и возможности. Мн.: Ураджай, 1989.с., ил.

6. Методы молекулярной генетики и генной инженерии/ Мазин А.В. и др. – Новосибирск: Наука. 1990. – 248 с.

7. Песецкая Л.Н., Гончаренко Г.Г. Сборник задач по генетике. Гомель: ГГУ, 2002. – 114с.

8. Уотсон Дж., Туз Дж., Курц Д. Рекомбинантные ДНК. Краткий курс: Пер. с англ.- М.: Мир, 1986.- 288 с., ил.

9. Льюин Б. Гены: – Пер. с англ. – М.: Мир, 1987. – 544 с., ил.

10. Modern genetic analysis. Griffiths et al. – Freeman and company. New York.

1999. – 675 p.

11. Principles of genetics. Snustad P., Simmons M. / Second edition – John Wiley & Sons. New York. 1999. – 876 p.

12. An introduction to genetic analysis. Griffiths et al. – Freeman and company. New York. 2000. – 730 p.

Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии ЗАНЯТИЕ 2

–  –  –

ЗАНЯТИЯ: Ознакомиться с ферментами ЦЕЛЬ рестрикции и способами получения гибридной ДНК от различных организмов, освоить методы гибридизации ДНК на примере решения типовых задач

2. Теоретическая часть Для того чтобы искусственным путем наделить какой-либо организм новыми наследственными свойствами, нужно ввести в него новый ген или несколько генов от другого организма. Причем нужно, чтобы эти гены в чужом организме начали "работать" – производить белки.

Осуществляется эта процедура с помощью двух операций "разрезания" и "сшивания". Роль портняжных инструментов играют ферменты рестриктазы и лигазы.

Рестриктазы (своеобразные молекулярные ножницы), действуя на двухцепочечную ДНК, "узнают" в ней определенную последовательность нуклеотидов. Причем, каждая рестриктаза узнает только свою последовательность ДНК, прикрепляется к ней и разрезает ее в месте прикрепления. Рестриктазам безразлично, чью ДНК разрезать – человека или растения, бактерии или вируса, лишь бы в ней были распознаваемые участки. Это значит, что две совершенно несхожих между собой последовательности ДНК (допустим из клеток слона и лягушки) при обработке одной и той же рестриктазой легко можно сшить (слепить) друг с другом. Обычно рестриктазы распознают в молекулах ДНК очень короткие, но строго специфичные для каждого фермента участки длиной в 4 – 6 пар нуклеотидов и разрезают обе цепи ДНК посередине этих участков или с некоторым смещением. В первом случае образуются обрывки с ровными (тупыми) концами, а во втором – стороны разрезаемых цепочек ДНК заходят одна за другую. Такие одноцепочечные концы называются "липкими", поскольку они могут как бы слипаться между собой в силу комплементарности.

Ярким примером рестриктазы второго типа является EcoRI, которая узнает фрагмент ДНК из шести нуклеотидов ГААТТЦ, и режет эту последовательность ДНК ассиметрично, «ступенькой» между нуклеотидами Г и А (рис. 1). В результате место разреза в одной цепи смещено по отношению к другой на 4 пары оснований. При таком разрезе Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 45

–  –  –

Рис. 1. а) схема действия фермента рестриктазы EcoR I на двухцепочечную молекулу ДНК, с указанием участка распознавания и места разреза; б) фрагменты ДНК с липкими концами после разрезания ферментом EcoR I.

образуется два выступающих конца. Эти концы притягиваются друг к другу, желая восстановить свои старые связи и скрепиться, как им и положено, водородными мостиками.

Если с той же EcoR1 получить фрагменты ДНК из различных организмов, то все они будут иметь одинаковые, подходящие друг к другу “липкие концы”. Скрепить выступающие липкие концы двух молекул ДНК помогает другой фермент - ДНК-лигаза. Он лигирует, то есть “сшивает“ между собой сахарофосфатные остовы двух фрагментов с образованием полной структуры двойной спирали ДНК. Внешне она ничем не Таблица 1. Некоторые рестриктазы и расщепляемые ими последовательности.

Рестриктазы Участки распознования и места разреза ДНК 5`-Г-Г-А-Т-Ц-Ц-3` Bam I 3`-Ц-Ц-Т-А-Г-Г-5`

–  –  –

отличается от обычной ДНК. Сейчас в арсенале генных инженеров имеется более 500 различных рестриктаз, способных разрезать ДНК примерно в 120 различных местах. Несколько рестриктаз и участки ДНК, которые они могут разрезать, представлены в таблице 1.

С помощью этих и некоторых других ферментов многие исследователи начали конструировать и конструируют в настоящее время разнообразные по своим составным частям гибридные (рекомбинантные) ДНК.

–  –  –

3. Примеры решения задач

3.1. Имеется последовательность из 39 нуклеотидных пар двухцепочечной ДНК следующего состава:

5`-ЦЦТТАГГЦЦТГААТТААГГЦААТАГТГТГААТТЦАЦАТГ-3` 3`-ГГААТЦЦГГАЦТТААТТЦЦГТТАТЦАЦАЦТТААГТГТАЦ-5` Каким способом и на сколько частей можно разрезать эту ДНК?

Решение:

В данной последовательности ДНК имеется два участка распознавания: ГААТТЦ для рестриктазы EcoR I и ГГЦЦ для Hae III (см.

таблицу 1). Поэтому искомая ДНК может быть разрезана в двух местах с образованием трёх различных фрагментов следующих последовательностей:

1) 5`-ЦЦТТАГГ- 2) -ЦЦТГААТТААГГЦААТАГТГТГГГААТЦЦ- -ГГАЦТТААТТЦЦГТТАТЦАЦАЦТТААААТТЦАЦАТГ-3`

-ГТГТАЦ-5`

3.2. Рестрикционный фермент Hind III разрезает ДНК по последовательности ААГЦТТ. Насколько часто этот фермент будет разрезать двухцепочечную ДНК? (Иными словами, какова средняя длина фрагментов разрезанной ДНК?).

Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 47

Решение:

Нам необходимо рассмотреть только одну цепочку ДНК, поскольку обе цепочки имеют одинаковые, симметричные последовательности, хотя и разнонаправленные. Частота встречаемости фрагмента из 6 нуклеотидных пар для Hind III составит (1/4)6 = 1/4096, так как вероятность для одного нуклеотида (допустим А) занять конкретное место в цепочке ДНК составляет, а таких мест имеется 6.

Следовательно, среднее расстояние между участками разрезания рестриктазой Hind III составит около 4 тысяч нуклеотидных пар (4 тысячи баз или 4 килобазы).

3.3. Гаплоидный геном человека содержит около 3109 нуклеотидных пар (н.п.) ДНК. Если вы порежете человеческую ДНК рестикционным ферментом EcoRI, узнающим гексамерную последовательность ГААТТЦ, то сколько различных рестрикционных фрагментов будет получено?

Решение:

Исходя из предположения, что четыре нуклеотида А, Т, Г, Ц находятся в равных количествах и распределяются в ДНК случайным образом, вероятность для любого из четырех нуклеотидов занять конкретное место в цепочке составляет. Вероятность для двух нуклеотидов (например, АГ) занять конкретное место составит = (1/4)2, а вероятность для специфической гексамерной последовательности будет равна (1/4)6 = 1/4096. Следовательно, EcoRI будет разрезать молекулу человеческой ДНК в среднем один раз на 4096 нуклеотидных пар. Если молекула ДНК разрежется n раз, то в результате получается n+1 фрагмент. Гаплоидный геном из 3 109 нуклеотидных пар содержит около 732 422 (3 109/4096) мест разреза для рестриктазы EcoRI. Если бы полный геном человеческой ДНК состоял из одной молекулы, то EcoRI могла бы разрезать его на 732 422 + 1 фрагмент. Но поскольку места разрезания распределены по 23 хромосомам, то в результате полного Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии расщепления человеческой ДНК рестриктазой EcoRI должно получится 732422 + 23 рестрикционных фрагмента.

3.4. Ниже приведены последовательности двух фрагментов ДНК, выделенных из организмов разных видов.

1) 5`-АГЦАТАЦТГТГААТТЦАЦА-3` 2) 5`-АТГААТТЦТТАГЦАТАЦ-3` 3`-ТЦГТАТГАЦАЦТТААГТГТ-5` 3`-ТАЦТТААГААТЦГТАТГ-5` С помощью каких ферментов можно получить гибридную молекулу ДНК из этих фрагментов? Опишите последовательные этапы получения гибридной молекулы.

Решение:

На первом этапе необходимо разрезать представленные фрагменты ДНК разных видов с помощью подходящих рестрикционных ферментов.

В данном случае можно использовать рестриктазу EcoRI, которая расщепит ДНК двух видов на четыре новых фрагмента 1а, 1б и 2а, 2б с липкими концами ААТТ и ТТАА:

1а) 5`-АГЦАТАЦТГТГ 1б) ААТТЦАЦА-3` 3`-ТЦГТАТГАЦАЦТТАА ГТГТ-5` 2а) 5`-АТГ 2б) ААТТЦТТАГЦАТАЦ-3` 3`-ТАЦТТАА ГААТЦГТАТГ-5` В ходе второго этапа необходимо смешать нужные нам фрагменты 1а и 2б. В результате выступающие липкие концы скрепятся между собой, как им и положено, водородными связями в силу комплементарности.

5`-АГЦАТАЦТГТГ А-А-Т-Т-ЦТТАГЦАТАЦ-3` 3`-ТЦГТАТГАЦАЦ-Т-Т-А-А ГААТЦГТАТГ-5` Окончательное скрепление фрагментов 1а и 2б двух молекул ДНК производит специализированный фермент ДНК-лигаза, которая “сшивает“ между собой сахарофосфатные остовы обоих фрагментов с образованием полной структуры двойной спирали ДНК.

4. Задачи для самоконтроля

4.1. Имеется последовательность из 27 нуклеотидных пар двухцепочечной ДНК следующего состава:

5`- ЦТГААТТАГГАТЦЦАГГЦААТАГТГТГ -3` 3`-ГАЦТТААТЦЦТАГГТЦЦГТТАТЦАЦАЦ-5` Каким способом и на сколько частей можно разрезать эту ДНК?

4.2. Имеется последовательность из 24 нуклеотидных пар двухцепочечной ДНК следующего состава:

5`-ТЦАГААТГЦТГГЦЦААГТАЦТТАГ-3` 3`-АГТЦТТАЦГАЦЦГГТТЦАТГААТЦ-5` Каким способом и на сколько частей можно разрезать эту ДНК?

Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 49

4.3. Ниже приведены две последовательности одноцепочечных молекул ДНК. Какую из них в двухцепочечной форме могут разрезать известные вам рестриктазы?

а) 5`-АЦТЦЦАГААТТЦАЦТЦЦГ-3` б) 5`-ГЦЦТЦАТТЦГААГЦЦТГА-3`

4.4. Ниже приведены три последовательности одноцепочечных молекул ДНК. Какую из них в двухцепочечной форме могут разрезать известные вам рестриктазы?

а) 5`-ТАГГЦТААГЦТТАЦЦГАТ-3` б) 5`-ЦГААТАТТТЦЦГГАТГАА-3` в) 5`-АГГТЦЦТТАТЦЦГАТААТТ-3`

4.5. Рестрикционный фермент Hpa II разрезает ДНК по последовательности ЦЦГГ. Какова средняя длина фрагментов разрезанной ДНК?

4.6. Рестрикционный фермент EcoRI разрезает ДНК по последовательности ГААТТЦ. Насколько часто этот фермент будет разрезать двухцепочечную ДНК?

4.7. Если последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК распределяется случайным образом, то какова будет средняя длина фрагмента при разрезании ДНК рестриктазами, узнающими последовательность из восьми нуклеотидов?

4.8. Гаплоидный геном человека содержит около 3109 нуклеотидных пар ДНК. Сколько различных рестрикционных фрагментов будет получено при разрезании человеческой ДНК рестрикционным ферментом Not I, узнающим октамерную последовательность ГЦГГЦЦГЦ?

4.9. Сколько различных рестрикционных фрагментов будет получено при разрезании человеческой ДНК рестикционным ферментом Sma I?

4.10. Гаплоидный геном дрожжевого грибка Saccharomyces cerevisiae, состоящий из одной хромосомы, содержит около 13,5 106 нуклеотидных пар ДНК. Если вы порежете эту ДНК ферментом EcoRI, то сколько различных рестрикционных фрагментов будет получено?

4.11. Гаплоидный геном Saccharomyces cerevisiae (13,5 106 н. п.) разрезали ферментом HaeIII. Сколько различных рестрикционных фрагментов будет получено?

4.12. Геном кишечной палочки Escherichia coli, представляющий собой одну кольцевую хромосому, содержит около 4,7 106 н. п. Его Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии разрезали ферментом HaeIII. Сколько различных рестрикционных фрагментов будет получено?

4.13. Геном Drosophila melanogaster, состоящий из четырёх хромосом, содержит около 108 нуклеотидных пар ДНК. Если вы порежете эту ДНК ферментом EcoRI, то сколько различных рестрикционных фрагментов будет получено?

4.14. Ниже приведены последовательности двух фрагментов ДНК, выделенных из организмов разных видов.

5`-АААГЦТТЦТГААТЦЦГАТЦГ-3` 3`-ТТТЦГААГАЦТТАГГЦТАГЦ-5` 5`-ГТАЦТЦАГАТЦЦТАГГАТААГЦТТА-3` 3`-ЦАТГАГТЦТАГГАТЦЦТАТТЦГААТ-5` С помощью каких ферментов можно получить гибридную молекулу ДНК из этих фрагментов? Опишите последовательные этапы получения гибридной молекулы.

4.15. Опишите последовательные этапы получения гибридной ДНК из представленных ниже фрагментов.

5`-ТАЦТАТЦЦГГАГТАГГАТЦЦТ-3` 3`-АТГАТАГГЦЦТЦАТЦЦТАГГА-5` 5`-ЦГГАТЦЦТАГАТТЦЦАТА-3` 3`-ГЦЦТАГГАТЦТААГГТАТ-5`

5. Литература

1. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика: Пер. с англ.: В 3 т. - М.: Мир, 1988., ил.

2. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика: Учеб. пособие. – Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та: Сиб. унив. изд-во, 2002. – 459 с., ил.

3. Картель Н.А. Биоинженерия: методы и возможности.- Мн.: Ураджай, 1989.с., ил.

4. Методы молекулярной генетики и генной инженерии/ Мазин А.В. и др. – Новосибирск: Наука. 1990. – 248 с.

5. Песецкая Л.Н., Гончаренко Г.Г. Сборник задач по генетике. Гомель: ГГУ, 2002. – 114с.

6. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии: Учеб. пособие для вузов.Мн.: Выш. шк., 1986.- 186 с.: ил.

7. Уотсон Дж., Туз Дж., Курц Д. Рекомбинантные ДНК. Краткий курс: Пер. с англ.- М.: Мир, 1986.- 288 с., ил.

8. Щелкунов С.Н. Конструирование гибридных молекул ДНК.- Новосибирск:

Наука, 1987.- 168 с.

9. Льюин Б. Гены:

- Пер. с англ.- М.: Мир, 1987.- 544 с., ил.

10. Modern genetic analysis/ Griffiths et al. – Freeman and company. New York.

1999. – 675 p.

Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 51

11. Principles of genetics. Snustad P., Simmons M. / Second edition – John Wiley & Sons. New York. 1999. – 876 p.

12. An introduction to genetic analysis. Griffiths et al. – Freeman and company. New York. 2000. – 730 p.

Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии ЗАНЯТИЕ 3 ТЕМА: анализ и использование фрагментов ДНК (ДНКовых последовательностей)

–  –  –

Если после электрофореза окрасить гель специальным красителем этидиум бромидом, связывающимся с ДНК и поместить гель под ультрафиолетовый свет, то на нем будут хорошо видны окрашенные в красный цвет, расположенные на различном расстоянии друг от друга светящиеся фракции ДНК. Каждая такая фракция соответствует одному фрагменту ДНК. Следует подчеркнуть, что разные рестриктазы дают разную картину расщепления одной и той же ДНК (электрофореграмма на рис. 1 справа). Таким образом, электрофорез в агарозном геле позволяет разделить, а затем легко извлечь любые рестрикционные фрагменты ДНК в чистом виде, для последующего использования. Кроме того, анализируя электрофоретические спектры ДНК на геле, наблюдая за исчезновением одних и появлением других фракций под действием разных рестриктаз, исследователи начали составлять генетические рестрикционные карты расположения участков ДНК для разных видов.

Первую полную физическую карту расположения участков 14 рестриктаз составил Д. Натанс для ДНК вируса SV-40.

В 1975 году был разработан метод, который позволяет идентифицировать конкретные гены и другие рестрикционные фрагменты ДНК после их электрофоретического разделения. Суть

–  –  –

метода заключается в том, что сначала фрагменты ДНК, разделенные в агарозном геле, денатурируются до одноцепочечных молекул, а затем весь электрофоретический спектр ДНК отпечатывается (blotting) за счет капиллярных сил на приложенной к гелю нитроцеллюлозной мембране (пленке), после чего фиксируется при помощи высокой температуры (рис. 2). Далее мембрана помещается в гибридизационный буфер, содержащий специальный радиоактивно меченый ДНКовый зонд – короткую специфическую последовательность ДНК. Зонд способен гибридизоваться с определенным комплементарным фрагментом ДНК и свяжется только с одной или несколькими конкретными фракциями из всего электрофоретического спектра полученных рестрикционных фрагментов ДНК. На последнем этапе к нитроцеллюлозной мембране, содержащей весь спектр полученных фрагментов ДНК, включая фракции, гибридизовавшиеся с радиоактивно меченым зондом, прикладывают рентгеновскую пленку. На пленке (авторадиограмме) после экспозиции выявляются засвеченные места, соответствующие расположению меченых фракций ДНК. Это метод получил название Саузерн-блот гибридизации в честь разработавшего его Эдварда Саузерна.

К настоящему времени удалось практически полностью расшифровать (прочитать) абсолютное большинство генов даже у таких сложных видов как человек и дрозофила. Для этих и многих других видов получено огромное количество различных ДНКовых зондов (проб), которые успешно используются в Саузерн-блот анализе.

2. Ключевые слова и понятия ферменты рестрикции идентификация генов и фрагменты ДНК рестрикционных фрагментов ДНК манипуляции с фрагментами ДНК денатурация ДНК электрофорез в агарозном геле blotting электрофоретическая камера нитроцеллюлозная мембрана скорость продвижения фрагментов радиоактивно меченый ДНКовый краситель этидиум бромид зонд разделение рестрикционных Саузерн-блот гибридизация фрагментов ДНК ДНК пробы выделение рестрикционных фракции гибридизовавшиеся с фрагментов ДНК из геля радиоактивно меченым зондом светящиеся фракции ДНК авторадиограмма Саузерн-блот анализ.

рестрикционные карты

3. Примеры решения задач

3.1. Фрагмент человеческой ДНК длиной 4 тысячи нуклеотидных пар имеет два сайта рестрикции для фермента EcoRI. Как будет выглядеть Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 55 электрофореграмма, окрашенная этидиум бромидом,

–  –  –

Рис. 4. Рестрикционная карта, построенная на основе анализа электрофоретического фракционирования фрагментов ДНК, полученных в результате действия двух различных рестриктаз и их смеси на нативную ДНК.

Тот факт, что сайт R2 расположен ближе к участку длиной 6 кб, следует из величины участков в 7 и 10 кб, полученных при разрезании исходной ДНК только рестриктазой № 2. Е С

3.3. Исследователям удалось выделить специальный зонд, способный гибридизоваться с участком 5 kb хлоропластной ДНК (хлДНК) у любых видов хвойных. 4 kb Авторадиограмма образцов хлоропластной ДНК 2 kb родительских видов пихт европейской (Е) и сибирской 1 kb (С), обработанных рестрикционным ферментом и результаты последующей Саузерн-блот гибридизации с использованием радиоактивного зонда представлены на рисунке справа. Каковы будут рестрикционные карты у родительских видов пихт?

Решение:

Исходя из данных, представленных на авторадиограмме, величина одного из фрагментов ДНК, которые гибридизуются со специальным зондом у деревьев пихты сибирской будет длиннее на 2 кб.

Рестрикционные карты двух видов пихт будут иметь следующий вид:

Пихта европейская 5 кб 1 кб 2 кб Пихта сибирская 4 кб 5 кб 1 кб

–  –  –

Проанализируйте полные взаимоотношения между полученными с помощью радиоактивной пробы спектрами ДНК членов семьи и геном болезни. Нарисуйте соответствующие хромосомные участки родителей.

Решение:

Использованные радиоактивные ДНК-пробы позволили выявить на авторадиограмме три фракции ДНК размером 5, 3 и 2 кб. Все члены семьи имеют 5-кб фрагмент. У пяти из шести членов семьи, имеющих заболевание, присутствуют 3 и 2-кб ДНК-фрагменты, тогда как у здоровых они отсутствуют. Следовательно, эти два фрагмента, вероятно,

–  –  –

D 2 kb 3 kb

3.7. Мутация, вызывающая болезнь – серповидно-клеточная анемия (СКА), обусловлена заменой всего одного нуклеотида в ДНК глобинового гена. Причем, в результате этой мутации пропадает сайт рестрикции для фермента MstII, который присутствует в нормальном гене. Как можно использовать эту информацию для консультации семей, проживающих в районах высокой концентрации этой мутации, на предмет выявления носителей данного наследственного заболевания?

Какие молекулярно-генетические эксперименты для этого необходимо провести?

Решение:

Мутацию -глобинового гена, приводящую к заболеванию можно достаточно легко выявлять, используя молекулярно-генетические методы.

Для этого необходимо индивидуальные образцы ДНК обработать рестриктазой MstII. Затем, полученные рестрикционные фрагменты подверг-нуть электрофоретическому фракционированию в агарозном геле с последующей Саузерн-блот гибридизацией, используя в качестве зонда меченый фрагмент -глобиновой ДНК.

Поскольку в результате мутационной замены нуклеотида в ДНК глобинового гена происходит потеря сайта рестрикции для MstII, который присутствует в нормальном гене, то на авторадиограмме (рис. 5) Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 59

–  –  –

Рис. 5. Авторадиограмма и рестрикционные карты, построенные на основе анализа электрофоретического фракционирования фрагментов ДНК -глобинового гена, полученных в результате действия рестриктазы Mst II.

образцов, взятых у здоровых людей будут присутствовать две фракции (размером 1.1 и 0.2 кб), тогда как в образцах, взятых у людей страдающих серповидно-клеточной анемией, будет присутствовать дополнительная «тяжелая» (неразрезанная) фракция ДНК (величиной 1.3 кб).

Таким образом, для консультации семей, проживающих в районах высокой концентрации мутации, вызывающей серповидно-клеточную анемию, наиболее целесообразно использовать молекулярно-генетические методы, включающие рестрикционный и Саузерн-блот анализ, которые дают возможность достаточно легко выявлять носителей данного заболевания.

4. Задачи для самоконтроля

4.1. Фрагмент человеческой ДНК длинной 2 тысячи нуклеотидных пар (2 килобазы) имеет один сайт рестрикции для фермента EcoRI.

Сколько фракций ДНК будет присутствовать на фореграмме, окрашенной этидиум бромидом, после электрофореза в агарозном геле образца этой ДНК, обработанной EcoRI?

4.2. Фрагмент мышиной ДНК длиной 8 тысяч нуклеотидных пар имеет два сайта рестрикции для фермента BamI.

Как будет выглядеть электрофореграмма, окрашенная этидиум бромидом, после электрофореза в агарозном геле образца этой ДНК, разрезанной этой рестриктазой на неровные части?

4.3. Кольцевая молекула митохондриальной ДНК (мтДНК) имеет один сайт рестрикции для рестриктазы EcoRI.

Сколько фракций ДНК будет присутствовать на фореграмме после электрофореза в агарозном геле образца этой ДНК, обработанной EcoRI?

4.4. Фрагмент бактериальной ДНК длиной 5 килобаз имеет один сайт рестрикции для фермента EcoRI и два сайта для BamI.

Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии Как будет выглядеть электрофореграмма после электрофореза в агарозном геле образца этой ДНК обработанной только EcoRI, только BamI, а также смесью этих двух рестриктаз?

4.5. Линейный фрагмент ДНК разрезается ферментами HindIII и SmaI, а затем двумя ферментами вместе. В результате проведенного электрофореза в агарозном геле с последующим

–  –  –

гибридизации с использованием радиоактивного зонда представлены на рисунке справа. При скрещивании между деревьями пихты европейской и пихты сибирской было получено 20 потомков.

Каковы будут их спектры на авторадиограмме после Саузерн-блот гибридизации с митохондриальным зондом в случае, когда материнскими деревьями служила пихта европейская, а пыльца бралась от пихты сибирской и при обратном скрещивании?

4.10. Мутация, вызывающая болезнь циклический фиброз (ЦФ), обусловлена заменой всего одного нуклеотида. Причем, в результате этой мутации пропадает сайт рестрикции для EcoRI, который присутствует в норме. Как можно использовать эту информацию для консультации семьи на предмет того являются ли они носителями данного наследственного заболевания? Какие молекулярно-генетические эксперименты для этого необходимо провести?

4.11. В ходе проведенного молекулярно-генетического анализа с использованием специального ДНК-зонда на циклический фиброз и Саузерн-блот гибридизации было установлено, что женщина в семье из задачи 4.10 является носителем этого заболевания. Она вышла замуж за неродственного мужчину, являющегося также гетерозиготой по ЦФ, но он является носителем другой мутации в этом же гене.

Оцените риск рождения у этой семейной пары детей, страдающих циклическим фиброзом.

4.12. Супружеская пара имеет 3х детей больных циклическим фиброзом (ЦФ). Их старший сын женился на своей троюродной сестре.

Он провел молекулярное тестирование с целью установить вероятность заболевания циклическим фиброзом своих детей. Три специальных ДНКовых зонда тесно сцепленных с геном, определяющим заболевание фиброзом, были использованы для молекулярного анализа генотипов у членов его семьи. Полученная авторадиограмма электрофорезированной ДНК у членов исследованной семьи представлена на рисунке ниже.

Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии Является ли старший сын в этой семье нормальной гомозиготой или носителем заболевания?

4.13. Исходя из представленной авторадиограммы электрофорезированной ДНК у членов исследованной семьи из предыдущей задачи, определите являются ли нормальными гомозиготами или носителями два его нормальных брата и сестра.

4.14. Используя представленную в задаче 4.12 авторадиограмму укажите, кто из родителей в этой семье является носителем аллеля несущего заболевание циклический фиброз?

4.15. Мужчина, страдающий доминантным наследственным заболеванием, болезнью Хантингтона имеет двоих взрослых детей. Его дети опасаясь, что могут оказаться носителями наследственного заболевания, решили провести молекулярно-генетическую диагностику родителей, а также супругов и эмбрионов своих будущих детей. В то же время, сами от такой диагностики отказались. Саузерн-блот анализ выявил двухаллельную систему (с аллельными фрагментами в 4.9 кб или

3.7 и 1.2 кб) по ДНК-маркеру, который показывает 4 процента рекомбинантов с болезнью Хантингтона. Родословная этой семьи с результатами проведенного Саузерн-блот анализа представлена ниже. Для каждого из двух проанализированных эмбриональных образцов, вычислите шанс, что зародыши унаследуют аллель, сцепленный с болезнью Хантингтона.

5. Задачи повышенной сложности

5.1. Болезнь Хантингтона (БХ) является аутосомно-доминантным заболеванием, при котором происходит нейродегенеративное расстройство, приводящее к летальному исходу. Поскольку четкие симптомы этой болезни начинают проявляться только в возрасте около 40 Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 63

–  –  –

Рис. 8. Рестрикционные карты (для HindIII) четырех типов ДНК, способных гибридизоваться с зондом G8.

Каковыми будут электрофоретические спектры рестрикционных фрагментов ДНК, обработанных HindIII, после Саузерн-блот гибридизации у людей, имеющих гомозиготные АА, BB, CC, DD и гетерозиготные АB, АC, АD, BC, BD и CD генотипы? Все ли они будут различаться между собой?

5.2. На рисунке 9 представлена родословная семи поколений членов венесуэльской семьи, в которой распространена болезнь Хантингтона.

Члены семьи были обследованы на предмет выявления генотипов (см.

задачу 5.1) четырехаллельной системы фрагментов ДНК, гибридизующихся с зондом G8.

Результаты обследования показаны на родословной, где черным цветом показаны члены семьи, страдающие БХ,

–  –  –

II III IV V VI VII Рис. 9. Родословная венесуэльской семьи с болезнью Хантингтона. Черным цветом показаны члены семьи, страдающие БХ, значки членов семьи, не доживших до обследования, зачеркнуты.

Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии а значки членов семьи, не доживших до обследования, зачеркнуты.

Какие выводы можно сделать, анализируя эту родословную на предмет связи типов ДНК, гибридизующихся с G8 и болезнью Хантингтона. Иными словами, с какими генотипами и аллелями ДНКмаркера связана болезнь Хантингтона в этой семье?

5.3. Каким образом можно объяснить наличие генотипа АС у здоровой женщины в шестом поколении (VI-5) венесуэльской семьи, представленной на рисунке 9?

5.4. Исходя из приведенных выше данных по венесуэльской семье (рис. 9), что можно сказать о степени сцепления ДНК-маркера с геном, обуславливающим болезнь Хантингтона.

5.5. Как могут приведенные в предыдущих задачах данные помочь в выявлении механизмов, обуславливающих первопричины болезни Хантингтона?

6. Литература

13. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика: Пер. с англ.: В 3 т. - М.: Мир, 1988., ил.

14. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика: Учеб. пособие. – Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та: Сиб. унив. изд-во, 2002. – 459 с., ил.

15. Картель Н.А. Биоинженерия: методы и возможности.- Мн.: Ураджай, 1989.с., ил.

16. Методы молекулярной генетики и генной инженерии/ Мазин А.В. и др. – Новосибирск: Наука. 1990. – 248 с.

17. Песецкая Л.Н., Гончаренко Г.Г. Сборник задач по генетике. Гомель: ГГУ, 2002. – 114с.

18. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии: Учеб. пособие для вузов.Мн.: Выш. шк., 1986.- 186 с.: ил.

19. Уотсон Дж., Туз Дж., Курц Д. Рекомбинантные ДНК. Краткий курс: Пер. с англ.- М.: Мир, 1986.- 288 с., ил.

20. Щелкунов С.Н. Конструирование гибридных молекул ДНК.- Новосибирск:

Наука, 1987.- 168 с.

21. Льюин Б. Гены:

- Пер. с англ.- М.: Мир, 1987.- 544 с., ил.

22. Modern genetic analysis/ Griffiths et al. – Freeman and company. New York.

1999. – 675 p.

23. Principles of genetics. Snustad P., Simmons M. / Second edition – John Wiley & Sons. New York. 1999. – 876 p.

24. An introduction to genetic analysis. Griffiths et al. – Freeman and company. New York. 2000. – 730 p.

Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 65 ЗАНЯТИЕ 4 ТЕМА: плазмидные вектора – специальные устройства для доставки и клонирования чужеродных генов ЗАНЯТИЯ: Ознакомиться с простейшими ЦЕЛЬ векторами, сконструированными на основе плазмид, освоить методы введения и клонирования чужеродных ДНК с помощью плазмидных векторов на примере решения типовых задач

1. Теоретическая часть С помощью ферментов рестриктаз и лигаз исследователи научились конструировать разнообразные по своим составным частям гибридные (рекомбинантные) ДНК, путём сшивки фрагментов разных видов in vitro.

Но как полученным гибридным генам попасть в клетку и начать там работать?

Для доставки чужеродных генов в различные организмы учёные стали применять специальные устройства, так называемые вектора.

Вектор – это молекула ДНК, способная самостоятельно реплицироваться в клетках различных организмов и обеспечивать размножение (клонирование) и работу (экспрессию) встроенного в неё искусственно какого-либо гена. В английской литературе вектор часто обозначается словом vehicle – повозка.

Идеальными векторными молекулами, созданными самой природой, оказались плазмиды, представляющие собой небольшие кольцевые молекулы ДНК, самостоятельно живущие в цитоплазме бактерий.

Плазмиды способны к автономной репликации, обладают генами устойчивости к различным антибиотикам, что позволяет легко обнаружить их присутствие в клетках, плазмиды могут внедряться в хромосому клетки хозяина, а также имеют участки ДНК (сайты рестрикции) для действия ряда рестриктаз. Это означает, что каждая такая рестриктаза может разрезать кольцо плазмидной ДНК и переводить её в линейное состояние. После чего линейную плазмиду можно легко соединить с фрагментом ДНК другого вида с подходящими липкими концами.

Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии Первым успешным который начали вектором-повозкой, использовать в генной инженерии, стала кольцевая плазмида pSC101. Она несет только один участок расщепления (сайт рестрикции) рестриктазой EcoR1 и превращается под действием этого фермента из кольцевой в линейную молекулу, концы которой могут «слипаться»

между собой или с любыми фрагментами другой ДНК, полученными под действием той же рестриктазы. Кроме того, она несет ген устойчивости к антибиотику тетрациклину, а значит легко обнаруживается в бактериях, если их растить на среде с этим антибиотиком. Все эти свойства pSC101 и были использованы для создания и клонирования первых гибридных (рекомбинантных) ДНК, которые были бы функционально активными, то есть могли бы стабильно существовать в клетке и наделять (трансформировать) ее новыми признаками. Этапы введения фрагмента чужеродной ДНК в плазмидный вектор pSC101 с помощью рестриктазы EcoR1 схематически показаны на рис. 1.

По мере развития методов генной инженерии совершенствовались и плазмидные вектора. Широкое распространение получила плазмида pBR322. У нее больше участков, разрезаемых различными рестриктазами, следовательно, с ней можно «сшивать» самые разные фрагменты ДНК. Более того, у pBR322 не один, а два маркера для селекции на бактериальных средах: помимо тетрациклина эта плазмида кодирует еще усEcoRI ДНК а) EcoRI EcoRI

–  –  –

АА ТТ Т Т А А А А Т Т Рис. 1. Введение фрагмента рекомбинантной молекулы ДНК в плазмидный вектор pSC101 с помощью рестриктазы EcoRI, образующей «липкие» концы: а)—разрезание молекул ДНК рестриктазой и образование фрагментов с «липкими» концами; б) — гибридизация и сшивание ферментом лигазой фрагментов ДНК.

Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 67

–  –  –

клонирования длиной около 200 н.п., содержащий 10 сайтов рестрикции.

В результате инсерции (вставки) чужеродной ДНК в полилинкер нарушается работа гена lacZ в плазмиде. Колонии бактерий содержащие нормальный и повреждённый вставкой гены легко различаются если поместить клетки в чашки Петри на среду содержащую субстрат Х-Gal, который расщепляется ферментом -галак-тозидазой (продукт гена lacZ), с образованием нерастворимого осадка сине-голубого цвета. Если образовались колонии, окрашенные в синий цвет, значит, в этих бактериальных клетках плазмиды не содержат вставки чужеродной ДНК.

В тоже время бактериальные клетки, которые содержат плазмиды со встроенной ДНК, образуют неокрашенные колонии. Следовательно, достаточно лишь взглянуть на трансформированные бактериальные клетки и можно с уверенностью сказать успешно ли прошло клонирование вставленной в плазмиду pUC18 чужеродной ДНК или нет.

Поэтому гены подобные lacZ получили название репортерных.

Помимо плазмид в качестве векторов стали успешно использовать фаги и вирусы. Позже были созданы космиды – особый тип векторов, сочетающих свойства плазмиды и фага.

Таким образом, последовательна была создана основная триада элементов техники генной инженерии: выделение генов, «сшивание» их с вектором, доставка гибридной структуры в конкретный (реципиентный) организм, где она сможет размножаться и наследоваться в потомстве.

–  –  –

3.1. Кольцевая плазмида pSC101 несет только один участок расщепления рестриктазой EcoR1. Какой из приведённых ниже фрагментов ДНК можно встроить в данную плазмиду?

5`-ЦЦГААТТЦАГАТГТААГГЦААТАГТГТГААТТЦАЦА-3` 3`-ГГЦТТААГТЦТАЦАТТЦЦГТТАТЦАЦАЦТТААГТГТ-5` 5`-ЦЦТТАГГЦЦТГААТТААГГЦААТАГТГТГААТЦАЦАТГ-3` 3`-ГГААТЦЦГГАЦТТААТТЦЦГТТАТЦАЦАЦТТАГТГТАЦ-5`

Решение:

Поскольку плазмида pSC101 несет один участок расщепления рестриктазой EcoR1, то в неё можно встроить только тот фрагмент ДНК, который также может быть разрезан рестриктазой EcoR1.

Поэтому из двух фрагментов двухцепочечной ДНК, приведённых выше, в плазмиду pSC101 можно встроить лишь первый, так как только он содержит участки разрезания для EcoR1.

Схематически этапы встраивания участка чужеродной ДНК изображены на рисунке:

EcoRI Чужеродная ДНК I EcoRI EcoRI 5`-ЦЦГ--ААТТЦАГАТГТААГГЦААТАГТГТГ--ААТТЦАЦА-3` 3`-ГГЦТТАА--ГТЦТАЦАТТЦЦГТТАТЦАЦАЦТТАА--ГТГТ-5` pSC101

–  –  –

А АГ Т ТТ Ц Ц Г А Т Ц Т Г Т А А А А Т Т На первом этапе EcoR I разрезает по сайтам рестрикции плазмиду и первую молекулу ДНК с образованием фрагментов ДНК с липкими концами. На втором этапе происходит гибридизация линейной молекулы плазмиды и фрагмента чужеродной ДНК с последующим образованием Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии кольцевой молекулы вектора со встроенным участком чужеродной ДНК и сшивание их при помощи фермента лигазы.

3.2. При помощи рестриктазы Pst I получен фрагмент двухцепочечной ДНК с липкими концами. Можно ли встроить данный фрагмент в плазмиду pBR322? Как подтвердить, что фрагмент чужеродной ДНК встроен в плазмиду pBR322?

Решение:

Данный фрагмент ДНК можно встроить в плазмиду pBR322, поскольку она несет участок расщепления рестриктазой Pst I. Процесс вставки фрагмента в плазмиду аналогичен таковому в предыдущей задаче.

На первом этапе под действием рестриктазы Pst I, узнающей последовательность ЦТГЦАГ, получают линейную молекулу плазмиды с липкими концами:

–  –  –

Так как сайт рестрикции для Pst I находится в гене устойчивости (резистентности) к ампициллину, то при вставке чужеродной ДНК по месту разреза будет нарушена целостность гена Ap. Соответственно

–  –  –

4. Задачи для самоконтроля

4.1. Ниже приведён фрагмент ДНК, можно ли встроить его в плазмиду pSC101?

5`-АГГЦЦТГААТТААГГЦААТАГТГТГААТЦА-3` 3`-ТЦЦГГАЦТТААТТЦЦГТТАТЦАЦАЦТТАГТ-5`

4.2. Ниже приведены два одноцепочечных фрагмента ДНК. Какой из них в двухцепочечном варианте можно использовать для встраивания в плазмиду pSC101?

а) 5`-ГГЦЦТГААТТЦААГЦАТАГТГТГААТТЦАА-3` б) 5`-ТЦЦГГАЦТТААТТГТТАТЦАЦАЦТТАГТ-5`

4.3. Кольцевая плазмида pBR322 имеет участки расщепления различными рестриктазами. Какой из ниже приведённых фрагментов двухцепочечной ДНК можно встроить в данную плазмиду?

5`-ЦЦГАТТЦАГАТГТААГГЦААТАГТГТГАТТЦАЦА-3` 3`-ГГЦТААГТЦТАЦАТТЦЦГТТАТЦАЦАЦТААГТГТ-5` Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 5`-ЦЦТТААГЦТТАГГЦТААГГЦААТАГААГЦТТТЦААТГ-3` 3`-ГГААТТЦГААТЦЦГАТТЦЦГТТАТЦТТЦГАААГТТАЦ-5`

4.4. Какой из ниже приведённых фрагментов двухцепочечной ДНК можно встроить в плазмиду pBR322?

5`-ЦЦГААТТЦАГАТГТААГГЦААТАГТГТГААТТЦАЦА-3` 3`-ГГЦТТААГТЦТАЦАТТЦЦГТТАТЦАЦАЦТТААГТГТ-5` 5`-ЦЦТТААГЦТТАГГЦТААГГЦААТАГААГЦТТЦАЦАТГ-3` 3`-ГГААТТЦГААТЦЦГАТТЦЦГТТАТЦ ТТЦГААГТГТАЦ-5`

4.5. В плазмиде pUC18 имеется полилинкерный участок, который содержит сайты рестрикции для 10 различных рестриктаз. Можно ли встроить в эту плазмиду приведённые ниже фрагменты двухцепочечной ДНК?

5`-ЦЦГААТТЦАГАТГТААГГЦААТАГТГТГААТТЦАЦА-3` 3`-ГГЦТТААГТЦТАЦАТТЦЦГТТАТЦАЦАЦТТААГТГТ-5` 5`-ЦЦТТААГЦТТАГГЦТААГГЦААТАГААГЦТТТЦААТГ-3` 3`-ГГААТТЦГААТЦЦГАТТЦЦГТТАТЦТТЦГАААГТТАЦ-5`

4.6. Имеется фрагмент двухцепочечной ДНК следующего состава:

5`- ТАГГАТЦЦАТТАААТАГТГГАТЦЦГТ -3` 3`-АТЦЦТАГГТААТТТАТЦАЦЦТАГГЦА-5` Можно ли встроить данный фрагмент в плазмиду pBR322? Как подтвердить, что фрагмент чужеродной ДНК встроен в плазмиду pBR322?

4.7. В плазмиду pBR322 вставлен фрагмент чужеродной ДНК.

Трансформированные такой плазмидой бактерии растут на питательной среде с ампициллином, но не растут на питательной среде, содержащей тетрациклин. Какой известной вам рестриктазой можно вырезать чужеродную ДНК из плазмиды?

4.8. Ген Ms находится в кольцевой плазмиде величиной 5 000 нуклеотидных пар (5 000 нп). Разрезание плазмиды рестрикционным ферментом Hind III дает фрагменты 1, 2 и 3, как показано на рисунке (H Hind III рестрикционные сайты):

800 нп Н Н

–  –  –

Тандемная копия гена Ms содержится только в одном Hind III фрагменте. Если ген Ms кодирует регуляторный белок MSS4, состоящий из 300 аминокислот, то укажите в каком фрагменте плазмиды расположены копии гена Ms?

–  –  –

Смесь SmaI

4.9. Фрагмент ДНК мыши величиной 4 кб, имеющий на концах сайты рестрикции для EcoRI, содержит ген М. Этот фрагмент был встроен в 7 kb плазмиду pBR322 по EcoRI сайту. Полученная 6 kb рекомбинантная плазмида была разрезана двумя 4 kb рестриктазами, электрофоретический спектр 2 kb полученных рестрикционных фрагментов, 1 kb окрашенных этидиум бромидом, представлен на рисунке 3. Для фракций на геле, полученных после разрезания сразу двумя ферментами, была проведена Рис. 3. ЭлектрофореСаузерн-блот гибридизация с использованием в грамма фрагментов качестве зонда меченого фрагмента плазмиды ДНК.

pBR322.

С какими фракциями ДНК произойдет гибридизация меченого зонда?

4.10. Ген для белка -тубулина был получен из грибка Neurospora, вставлен в кольцевую плазмиду и клонирован в бактерии E.coli. Опишите шаг за шагом последовательность действий, необходимых для того, чтобы клонировать этот ген от родственного грибка Podospora, используя в качестве вектора кольцевую плазмиду pBR, представленную на рисунке справа, которая несет два гена устойчивости к антибиотикам канамицину (kan) и тетрациклину (tet).

4.11. Фрагмент человеческой ДНК величиной 6 HindIII

–  –  –

гибридизация с меченым зондом из плазмиды pBR322.

С какими фракциями ДНК в этом случае произойдет гибридизация меченого зонда?

4.12. Исследователи для клонирования важного фрагмента человеческой ДНК величиной 1кб использовали плазмиду pUC18.

Трансформированные гибридной плазмидой клетки E. coli были помещены на питательную среду, содержащую X-Gal. После культивирования в чашках Петри появились колонии синего и белого цвета. Удалось ли встроить нужный фрагмент человеческой ДНК в плазмиду pUC18?

4.13. Интересный фрагмента человеческой ДНК величиной 1 кб был встроен в плазмиду pUC18 по Hind III сайту и клонирован в E. coli. Если выделить гибридную плазмиду и разрезать рестриктазой Hind III то как будет выглядеть спектр фрагментов после электрофореза в агарозном геле в случае когда человеческая ДНК успешно встроилась в pUC18 и когда этого не произошло?

4.14. Изменится ли электрофоретический спектр фрагментов после электрофореза в агарозном геле если, выделенную по условиям задачи

4.13 гибридную плазмиду pUC18 разрезать сразу двумя рестриктазами Hind III и EcoR1?

5. Задачи повышенной сложности

5.1. Исследователи получили трансгенные растения табака, в которые, используя в качестве вектора специализированную Тi-плазмиду, был введен нужный ген вместе с подсоединенным к нему канамицинустойчивым геном предварительно встроенные во фрагмент ТДНК плазмиды. Наследование вставленного нужного гена тестировалось у потомков по устойчивости к канамицину. Для проверки было взято два трансгенных растения. Было проведено возвратное скрещивание трансгенного растения №1 с табаком дикого типа, при этом 50% потомков оказались канамицин устойчивыми, а 50% – чувствительными. Когда возвратное скрещивание при помощи линии табака дикого типа было проведено с трансгенным растением №2, то 75% потомков были канамицин устойчивыми, и только 25% – чувствительными.

Какова разница между трансгенными растениями №1 и №2?

5.2. С помощью Ti-плазмиды, содержащей ген устойчивости к канамицину, исследователи провели трансформацию растения Arabidopsis Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии 75 thaliana. Были выделены два клона (А и Б), устойчивые к канамицину.

После самоопыления растений получили следующие результаты:

Растение А 3/4 потомков устойчивы к канамицину, 1/4 потомков чувствительны к канамицину;

Растение Б 15/16 потомков устойчивы к канамицину, 1/16 потомков чувствительны к канамицину.

Схематически изобразить соответствующие хромосомы у растения А и растения Б и объяснить полученное соотношение фенотипов в F1 у потомства растений А и Б после самоопыления.

5.3. Структурный ген величиной 0,5 кб, выделенный из генома человека имеет на одном конце сайт рестрикции для фермента рестриктазы EcoR1, а на другом для Hind III. Можно ли клонировать этот ген в E. coli при помощи плазмиды pUC18?

6. Литература

25. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика: Пер. с англ.: В 3 т. - М.: Мир, 1988., ил.

26. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика: Учеб. пособие. – Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та: Сиб. унив. изд-во, 2002. – 459 с., ил.

27. Картель Н.А. Биоинженерия: методы и возможности.- Мн.: Ураджай, 1989.с., ил.

28. Методы молекулярной генетики и генной инженерии/ Мазин А.В. и др. – Новосибирск: Наука. 1990. – 248 с.

29. Песецкая Л.Н., Гончаренко Г.Г. Сборник задач по генетике. Гомель: ГГУ, 2002. – 114 с.

30. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии: Учеб. пособие для вузов.Мн.: Выш. шк., 1986.- 186 с.: ил.

31. Уотсон Дж., Туз Дж., Курц Д. Рекомбинантные ДНК. Краткий курс: Пер. с англ.- М.: Мир, 1986.- 288 с., ил.

32. Щелкунов С.Н. Конструирование гибридных молекул ДНК.- Новосибирск:

Наука, 1987.- 168 с.

33. Льюин Б. Гены:

- Пер. с англ.- М.: Мир, 1987.- 544 с., ил.

34. Modern genetic analysis/ Griffiths et al. – Freeman and company. New York.

1999. – 675 p.

35. Principles of genetics. Snustad P., Simmons M. / Second edition – John Wiley & Sons. New York. 1999. – 876 p.

36. An introduction to genetic analysis. Griffiths et al. – Freeman and company. New York. 2000. – 730 p.

Гончаренко Г. Г. Основы генетической инженерии ЗАНЯТИЕ 4 ТЕМА: плазмидные вектора – специальные устройства для доставки и клонирования чужеродных генов ЗАНЯТИЯ: Ознакомиться с простейшими ЦЕЛЬ векторами, сконструированными на основе плазмид, освоить методы введения и клонирования чужеродных ДНК с помощью плазмидных векторов на примере решения типовых задач

1. Теоретическая часть С помощью ферментов рестриктаз и лигаз исследователи научились конструировать разнообразные по своим составным частям гибридные (рекомбинантные) ДНК, путём сшивки фрагментов разных видов in vitro.

Но как полученным гибридным генам попасть в клетку и начать там работать?

Для доставки чужеродных генов в различные организмы учёные стали применять специальные устройства, так называемые вектора.

Вектор – это молекула ДНК, способная самостоятельно реплицироваться в клетках различных организмов и обеспечивать размножение (клонирование) и работу (экспрессию) встроенного в неё искусственно какого-либо гена. В английской литературе вектор часто обозначается словом vehicle – повозка.

Идеальными векторными молекулами, созданными самой природой, оказались плазмиды, представляющие собой небольшие кольцевые молекулы ДНК, самостоятельно живущие в цитоплазме бактерий.



Pages:   || 2 |



Похожие работы:

«Государственное учреждение Областной социально-реабилитационный центр для несовершеннолетних "Добрый дом" Методические рекомендации по применению технологий работы с семьями и д...»

«2 Содержание ЦЕЛЕВАЯ УСТАНОВКА И ОРГАНИЗАЦИОННО-МЕТОДИЧЕСКИЕ I. 4 УКАЗАНИЯ Цель дисциплины 4 Учебные задачи дисциплины 4 Объем программы курса в академических часах 5 Формы контроля 5 СОДЕРЖАНИЕ ПРОГРАММЫ ДИС...»

«Государственное автономное образовательное учреждение высшего образования города Москвы "МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ИНСТИТУТ ИНДУСТРИИ ТУРИЗМА имени Ю.А.СЕНКЕВИЧА" (ГАОУ ВО МГИИТ имени Ю.А. Сенкевича)...»

«12+ УДК 373.167.1:004 ББК 32.81я72 Л54 Модульный курс "Я сдам ЕГЭ!" создан авторским коллективом из числа членов Федеральной комиссии по разработке контрольных измерительных материалов и экспертов ЕГЭ. Он включает методическое пособие "Методика...»

«ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ О СДЕЛКАХ С НЕДВИЖИМОСТЬЮ С ОСНОВАМИ НАСЛЕДСТВЕННОГО ПРАВА Методические указания для самостоятельной работы студентов бакалавриата направления 120700 САНКТ-ПЕТЕРБУРГ Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего п...»

«Методические рекомендации по внедрению и использованию свободного программного обеспечения в образовательных учреждениях Российской Федерации Москва...»

«Методические рекомендации по заполнению анкеты при поступлении на муниципальную службу в органы местного самоуправления муниципального образования городской округ "Охинский" При поступлении на муниципальную службу гражданин в соответствии с требованиями статьи 16 Федерального закона от 02.03.2007 № 25-ФЗ...»

«Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Вятский государственный университет" (ФГБОУ ВПО "ВятГУ") Методические рекомендации Составление рецензии на образовательную программу Киров Методические...»

«3 Методические указания по организации аудиторной работы по дисциплине "Операционные системы" предназначены для студентов, обучающихся по направлению подготовки 09.03.02 "Информационные системы и технологии", и содержат прогр...»

«МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО И З М Е Р Е Н И Ю К О Н Ц Е Н Т Р А Ц И Й ВРЕДНЫХ ВЕЩЕСТВ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ Вы пуск 21/1 Москва 1987 ленточные кружева М ИНИСТЕРСТВО 2 Я Р А В О О Х Р А Н Ш Я СССР М ТЩ Ч С И ГШХНИЯ Е И ЕКЕ П И М Ш КОНЦ РА И В Д Ы В Щ С...»

«МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ВВЕДЕНИЮ ФГОС НОО № Вопрос Ответ 1. Какие нормативные 1.Приказ Министерства образования и науки Российской Федерации от 26 ноября 2010 года " О внесении документы определяет изменений в федеральный государственный образовательный стандарт основного общего образования, изменения...»

«1 МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ ПРИМЕРНОЙ ОСНОВНОЙ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЙ ПРОГРАММЫ ДОШКОЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ПРИ РАЗРАБОТКЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЙ ПРОГРАММЫ ДОШКОЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ В ОБ...»

«"Разработка и реализация совместных образовательных программ в рамках Университета ШОС"Докладчик: Кольцова Наталья Валерьевна, к. и. н., доцент кафедры востоковедения, руководитель проектной группы "Развитие взаимодействия с базовыми (головными) вузами Университета ШО...»

«Ю. В. Улихина Н. К. Токжигитова ЦИОННЫЕ А СИСТЕМЫ Учебное пособие Павлодар Министерство образования и науки Республики Казахстан * Павлодарский государственный университет им. С. Торайгырова Ю. В. Улихина Н. К. Тоюкигитова I ОПЕРАЦИОННЫЕ СИСТЕМЫ Учебное пособие ПЩПЭЛЛР...»

«Уральский УТЦ ГА ПРАКТИЧЕСКАЯ АВИАЦИОННАЯ МЕТЕОРОЛОГИЯ Учебное пособие для летного и диспетчерского состава ГА Составила преподаватель Уральского УТЦ ГА Позднякова В.А. г. Екатеринбург 2010 г. Содержание страницы Содержание 2-4 1 Строение атмосферы...»

«Учреждение образования "БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" Кафедра физического воспитания и спорта ОСНОВЫ ФИЗИЧЕСКОЙ ПОДГОТОВКИ И САМОСТОЯТЕЛЬНЫХ ЗАНЯТИЙ СТУДЕНТОВ Учебно-методическое пособие для студентов всех специальностей Минск 2013 УДК 796(0...»

«Методические рекомендации для студентов к практическим занятиям по патологической анатомии на кафедре патологической анатомии с секционным курсом и курсом патологии II курс стоматологический факультет Тема: "Некроз. Апоптоз. Инфаркт".1. Цель занятия. Изучить вопросы этиологии,...»

«Статистические показатели деятельности библиотек вузов Западной Сибири Методические рекомендации к заполнению таблицы 1. Научная библиотека Томского государственного университета составила настоящие рекомендации в целях оказания помощи вузовским библиотекам в ежегодном...»

«Администрация городского округа Самара Муниципальное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Самарская академия государственного и муниципального управления" Кафедра "Менеджмент" Методические рекомендации к тес...»

«МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПУТЕЙ СООБЩЕНИЯ (МИИТ) _ Гуманитарный институт_ Кафедра "Политология и социальные технологии" К.В. СКВОРЦОВ МАССОВЫЕ КОММУНИКАЦИИ И МЕДИАПЛАНИРОВАНИЕ Методические указания к курсовой работе для студентов специальности "Реклам...»

«Методические рекомендации по составу квалифицированного сертификата ключа проверки электронной подписи Версия 1.9 1 Оглавление 2 Список изменений 3 Введение 3.1 Назначение документа 3.2 Цели и требования 3.3 Термины и определения 4 Структура сертификата 4.1 Общие положения 4.2 Состав СКПЭП 4.3 Состав имени субъекта...»

«Учебное пособие: Коммутаторы локальных сетей D-Link Четвертое издание Москва, 2006 Коммутаторы локальных сетей D-Link Оглавление ВВЕДЕНИЕ. КРАТКИЙ ОБЗОР ПРИНЦИПОВ СЕТЕВОГО ПРОЕКТИРОВАНИЯ ЭВОЛЮЦИЯ ЛОКАЛЬНЫХ СЕТЕЙ: ОТ РАЗДЕЛЯЕМОЙ СРЕДЫ ПЕРЕДАЧИ...»

«PEMPAL Казначейское сообщество Тематическая группа по консолидации Методические рекомендации по руководству по консолидации ПРОЕКТ Сентябрь 2014 КС PEMPAL – Методические рекомендации по консолидации Содержание Contents 1 ДЛЯ КОГО ПРЕДНАЗНАЧЕНЫ ДАННЫЕ...»








 
2017 www.book.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.