WWW.BOOK.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные ресурсы
 
s

«(51) МПК C12N 1/10 (2006.01) C12Q 1/08 (2006.01) C12R 1/90 (2006.01) ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ, ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ (12) ОПИСАНИЕ ...»

RU 2 412 991 C2

(19) (11) (13)

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

(51) МПК

C12N 1/10 (2006.01)

C12Q 1/08 (2006.01)

C12R 1/90 (2006.01)

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА

ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,

ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

(21)(22) Заявка: 2009103545/10, 03.02.2009 (72) Автор(ы):

Карташев Владимир Васильевич (RU), (24) Дата начала отсчета срока действия патента: Амбалов Юрий Михайлович (RU) 03.02.2009 (73) Патентообладатель(и):

Приоритет(ы): Государственное образовательное RU (22) Дата подачи заявки: 03.02.2009 учреждение высшего профессионального образования "Ростовский государственный (43) Дата публикации заявки: 10.08.2010 Бюл. № 22 медицинский университет Федерального (45) Опубликовано: 27.02.2011 Бюл. № 6 агентства по здравоохранению и социальному развитию (ГОУ ВПО (56) Список документов, цитированных в отчете о "РостГМУ росздрава") (RU), поиске: HIJJAWI N.S., MELONI B.P. et. al. Complete Карташев Владимир Васильевич (RU), development of Cryptosporidium parvum in host Амбалов Юрий Михайлович (RU) cell-free culture. Int. J. Parasitol. 2004. Jun., 34(7), p.769-777. RU 2272834 C2, 27.03.2006. RU 2255974 C1, 10.07.2005. RU 2255977 C1, 10.07.2005. HIJJAWI N.S., MELONI B.P. et. al.

Successful in vitro cultivation of Cryptosporium andersoni: evidence for the (см. прод.) C2 C2

–  –  –

(56) (продолжение):

existence of novel extracellular stages in the life cycle and implications for the classification of Cryptosporium. 2002. Dec.19; 32(14):1719-1726. Интернет http://dasnovamed.ru/convent/view/32/1, 2007.

Интернет labx.narod.ru/AVTOREFERATY/avtoreferat-30.pdf., 2007. Под ред. ЛАБИНСКОЙ А.С. и др.

Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований. - М., Медицина, 2005, с.559. Под ред. ГЕРХАРДТА Ф. и др. Методы общей бактериологии. - М., МНР, 1983, с.331-332.

.: 1

–  –  –

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии и паразитологии, и может быть использовано для культивирования микроорганизмов, таких как, например, криптоспоридий, трихомонад и пр. в искусственных питательных средах, не содержащих клеток хозяина.

Культивирование микроорганизмов in vitro имеет большое значение для изучения новых противомикробных препаратов, расшифровки эволюционной биологии и жизненного цикла микроорганизмов, оценки их жизнеспособности при эпидемиологических исследованиях. Преимущества способов культивирования микроорганизмов в среде, не содержащей клеток хозяина, животных или человека, заключаются в гораздо меньших материальных и технических затратах. Такие среды позволяют получить чистые антигены отдельных стадий развития микроба без примесей белков клеток хозяина для создания вакцин, бесклеточные среды упрощают исследование in vitro потенциальных средств противомикробного действия.

Некоторые микроорганизмы с трудом удается выращивать на твердых или жидких питательных средах, но они гораздо более активно растут и размножаются в двухфазных питательных средах, состоящих из комбинации твердой и жидкой фаз.

Возможным объяснением может быть то, что подобные двухфазные питательные среды создают условия роста и размножения, приближенные к естественным, когда часть стадий жизненного цикла микроба требует твердой питательной среды, а другие стадии жизненного цикла проходят в жидкой питательной среде.





Это, в частности, свойственно микроорганизмам, которые частично размножаются в клетках слизистых оболочек, а частично - на поверхности слизистой в просвете органа, например в кишечнике. При этом состав компонентов жидкой и твердой фазы питательной среды определяется особенностями биологии конкретного микроорганизма. Существуют такие питательные двухфазные среды, в которых в качестве твердой фазы используют коагулированную сыворотку, например, крупного рогатого скота, лошади и пр.

Проведенным поиском по научно-медицинской и патентной литературе найдены различные питательные двухфазные среды для культивирования микроорганизмов с использованием в качестве твердой фазы коагулированной сыворотки.

Так, патентом Российской Федерации №2272834 (2006 г., БИПМ №9) защищена питательная двухфазная среда для выделения одноклеточных микроорганизмов трихомонад. Жидкая фаза содержит питательную среду 199 с антибиотиками. Твердая фаза представлена коагулированной сывороткой крупного рогатого скота или лошади. Недостатком такой среды является то, что твердая фаза нестабильна и в процессе культивирования возможен переход ее частиц в жидкую фазу.

Наиболее близким техническим решением, принятым нами в качестве прототипа, является двухфазная питательная среда, использованная авторами из Австралии для культивирования микроорганизмов, а именно криптоспоридий, которые с трудом удается выращивать в искусственных условиях и в отсутствии клеток хозяина (Hijjawi NS, Meloni BP, Ng'anzo M, Ryan UM, Olson ME, Сох РТ, Monis PT, Thompson RC. Complete 45 development of Cryptosporidium parvum in host cell-free culture. Int J Parasitol. 2004 Vol.34, No. 7, p.769-777.). Этими авторами было показано, что наиболее активный рост и размножение криптоспоридий наблюдались в двухфазной питательной среде, которая включала жидкую и твердую фазы. Жидкая фаза питательной среды была представлена средой RPMI-1640 с добавлением к ней дополнительных компонентов.

Твердая фаза состояла из коагулированной сыворотки новорожденного теленка.

Недостатком прототипа является недостаточная стабильность твердой фазы двухфазной среды, за счет чего в процессе культивирования возможен переход.: 3

–  –  –

фрагментов твердой фазы в жидкую фазу. Это затрудняет, а в ряде случаев делает невозможным оценку результатов динамики роста культуры, т.е. результатов культивирования конкретных микроорганизмов, и таким образом снижает достоверность результатов исследования.

Целью предлагаемого изобретения является стабилизация твердой фазы двухфазной среды и предупреждение перехода фрагментов твердой фазы питательной среды в жидкую фазу.

Поставленная цель достигается тем, что содержащая коагулированную сыворотку твердая фаза двухфазной среды для культивирования микроорганизмов дополнительно содержит агарозу при соотношении компонентов твердой фазы: 1 г сухой агарозы на каждые 50 мл жидкой сыворотки.

Подробное описание приготовления питательной двухфазной среды для культивирования микроорганизмов представлено ниже.

Для приготовления твердой фазы берут стерильную сыворотку новорожденного теленка (например, Sigma-Aldrich, Cat. No. N4637) в объеме 10 мл и помещают в стерильную камеру для культивирования объемом 50 мл с площадью основания 25 см 2 (например, BD Falcon Cell Culture Flask, BD Bioscience, USA. Cat. No. 353014). К сыворотке в стерильных условиях добавляют сухую агарозу (например, Sigma-Aldrich, Cat. No. A9539) в количестве 0,2 г, и перемешивают путем многократного пипетирования до получение однородной смеси. После перемешивания смесь сыворотки новорожденного теленка и агарозы коагулируют при 70-80°С (например, в термостате LOIP LT-108a, ТЖ-ТС-01/8-100) в течение 45 минут. После коагуляции смесь сыворотки с агарозой охлаждают до комнатной температуры.

Состав жидкой фазы питательной среды определяют исходя из биологических особенностей конкретного культивируемого микроорганизма. Жидкую фазу в объеме 40 мл вносят в камеру для культивирования, содержащую описанную выше твердую фазу, т.е. коагулированную смесь сыворотки с агарозой.

В результате полимеризации агарозы в процессе коагуляции сыворотки агароза образует инертную матрицу, выполняющую роль арматуры для коагулированной сыворотки и способствует стабилизации последней, что препятствует переходу фрагментов коагулированной сыворотки в жидкую фазу двухфазной питательной среды.

Практическая реализуемость использования предлагаемой питательной двухфазной среды для культивирования микроорганизмов, в частном случае - криптоспоридий, подтверждается следующим примером.

Пример Для приготовления твердой фазы заявляемой питательной двухфазной среды брали стерильную сыворотку новорожденного теленка (Sigma-Aldrich, Cat. No. N4637) в количестве 10 мл и внесли в стерильную камеру для культивирования объемом 50 мл с площадью основания 25 см 2 (BD Falcon Cell Culture Flask, BD Bioscience, USA. Cat. No.

353014). К сыворотке в стерильных условиях добавили сухую агарозу (Sigma-Aldrich, Cat. No. А9539) в весовом количестве 0,2 г и перемешали путем повторного пипетирования до получения однородной смеси. Смесь сыворотки новорожденного теленка и агарозы в указанной выше пропорции подвергали коагуляции при 70-80°С в течение 45 минут в термостате LOIP LT-108a ТЖ-ТС-01/8-100. После коагуляции смеси сыворотки с агарозой ее охладили до комнатной температуры.

Для приготовления жидкой фазы двухфазной среды для культивирования Cryptosporidium parvum брали среду RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, Cat. No.

.: 4 RU 2 412 991 C2 R8758) в объеме 80 мл и в стерильных условиях вносили ее в стерильный флакон емкостью 150 мл. К указанному объему среды добавляли 0,003 г L-глютамина (SigmaAldrich, Cat. No. G3126), 0,3 г бикарбоната натрия (Sigma-Aldrich, Cat. No. S5761), 0,02 г бычьей желчи (Sigma-Aldrich, Cat. No. B3883), 0,1 г глюкозы (Sigma-Aldrich, Cat. No.

49158), 25 мкг фолиевой кислоты (Sigma-Aldrich, Cat. No. F7876), 100 мкг 4аминобензойной кислоты (Sigma-Aldrich, Cat. No. 06930), 50 мкг пантотената кальция (Sigma-Aldrich, Cat. No. C8731), 875 мкг аскорбиновой кислоты (Sigma-Aldrich, Cat. No. A5960), 1% эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma-Aldrich, Cat. No. F2442), 0,36 г HEPES (Sigma-Aldrich, Cat. No. H3375), 10000 ЕД калиевой соли пенициллина G (Sigma-Aldrich, Cat. No. P7794), 0,01 г стрептомицина сульфата (Sigma-Aldrich, Cat. No.

S6501). Конечный объем среды доводили до 100 мл путем добавления необходимого объема среды RPMI-1640. Показатель рН жидкой фазы доводили до 7,4 с помощью 0,1 Н раствора NaOH (Sigma-Aldrich, Cat. No. S8045). Приготовленную среду стерилизовали путем фильтрования через целлюлозно-ацетатный фильтр с размером пор 0,20 мкм (Cole-Parmer, Cat. No. RK-06731-20) и собирали в стерильный флакон емкостью 150 мл.

Приготовленная таким образом жидкая фаза среды в объеме 40 мл была внесена в камеру для культивирования с описанной выше твердой фазой.

В стерильных условиях в камеру для культивирования, содержащую двухфазную питательную среду указанного выше состава, был произведен посев исследуемого материала, представляющего собой ооцисты Crypto-sporidium parvum в количестве 1000000. Ооцисты были выделены из испражнений больного и прошли предварительные этапы очистки и обеззараживания (Arrowood MJ.. In vitro cultivation of Cryptosporidium species. Clinical Microbiology Reviews. 2002, Vol.15, No. 3, p.390-400.).

Инкубацию посевов осуществляли при 37°С в атмосфере с содержанием 5% СO2 в термостате ESPEC N2-O2-CO2 Culture Box. На 1-й, 3-й, 4-й, 8-й, 9-й, 17-й, 20-й и 48-й день инкубации отбирали по 10 мл жидкой фазы питательной среды. Вместо отобранных из камеры для культивирования 10 мл жидкой фазы, в камеру каждый раз вносили 10 мл стерильной свежеприготовленной жидкой фазы питательной среды.

Отобранные для исследования культуры 10 мл жидкой фазы питательной среды каждый раз помещали в стерильные пластиковые пробирки емкостью 15 мл и центрифугировали при ускорении 1000 g в течение 10 мин. После центрифугирования удаляли надосадочную жидкость. В осадке с помощью микроскопа Olympus BX51 исследовали динамику роста и развития культуры криптоспоридий.

За время наблюдения за культурой в указанные выше сроки не было зафиксировано ни одного случая перехода компонентов твердой фазы питательной среды в жидкую фазу.

Таким образом, приготовленная предлагаемым способом питательная двухфазная среда была стабильной, что позволило с высокой степенью достоверности выполнить оценку стадий роста и развития культуры криптоспоридий.

С помощью предлагаемой питательной двухфазной среды для культивирования микроорганизмов были исследованы 48 культур криптоспоридий. Ни в одном случае не было отмечено перехода фрагментов твердой фазы в жидкую фазу, что позволило на всех этапах исследования и во всех 48 случаях получить достоверные результаты оценки роста и развития культуры.

При использовании прототипа в 7 из 12 случаев культивирования (58,3%) наблюдался переход фрагментов твердой фазы питательной среды в жидкую фазу, начиная с 17-го дня наблюдения. В результате этого после центрифугирования.: 5 RU 2 412 991 C2 отобранных для исследования 10 мл жидкой части питательной среды на дне пробирки образовывался осадок из фрагментов твердой фазы питательной среды, препятствующий микроскопическому изучению культуры и оценке динамики ее роста и развития.

Таким образом, по сравнению с прототипом предлагаемая питательная двухфазная среда стабильна, фрагменты твердой фазы не переходят в жидкую, что позволяет существенно повысить достоверность оценки результатов культивирования микроорганизмов.

Формула изобретения Питательная двухфазная среда для культивирования микроорганизмов, содержащая жидкую фазу, состав которой определяется биологическими особенностями конкретного микроорганизма, и твердую фазу из коагулированной сыворотки, отличающаяся тем, что твердая фаза дополнительно содержит агарозу при следующем соотношении компонентов твердой фазы: 1 г сухой агарозы на каждые 50 мл жидкой сыворотки.

.: 6 CL




Похожие работы:

«Вторая часть Квантовой психобиологии. Наталия Осьминина Путешествие в Зазеркалье Прежде, чем начать читать эту книгу, вам надо обратиться к ее началу. А начало это лежит в первой части Квантовой психологии "Диктант в лунную ночь, или Путешествие в Зазеркалье". По суще...»

«Администрация Алтайского края Управление Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Алтайскому краю Международная ассоциация "Вода – Медицина – Экология" НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина РАМН Институт водных и экологических проблем СО РАН Конгресс Пра...»

«ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 3 2012 СЕРЫЯ БІЯЛАГІЧНЫХ НАВУК УДК 579.22:582.28:66.081 В. В. ЩЕРБА, Т. А. ПУЧКОВА, Л. Т. МИШИН ОБРАЗОВАНИЕ СОЕДИНЕНИЙ ИНДОЛЬНОЙ ПРИРО...»

«А А У К Алексей Иванович ЛНШВ УДК 564.53:551.763.13'3(09){571.6) ЗАКОНОМЕРНОСТИ ИСТОРИЧЕСКОГО РАЗВИТИЯ АЛЬБСКИХ И Р Н Е Е О А С И А М Н И Е (DESMOCERATACEAE А Н С В М Н К Х М О О ДЙ И НОРЫТАСЕАЕ ) СЕВЕРО-ВОСТОКА. СССР 04.00.09 палеонтология х стратиграфия Автореферат диссертации на соискание ученой...»

«УДК 622.23:504.3.054 © Т.И. Долгова, И.Г. Миронова, А.В. Павличенко ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ РАСТЕНИЙ ПРОИЗРАСТАЮЩИХ В ЗОНЕ ВЛИЯНИЯ ВЫБРОСОВ ЖЕЛЕЗОРУДНЫХ ШАХТ Выполнены исследования состояния растений произрастающих на территор...»

«Министерство здравоохранения Российской Федерации Федеральное медико-биологическое агентство ФГБУ НИИДИ ФМБА России Северо-Западное отделение РАМН Комитет по здравоохранению Правительства Санкт-...»

«ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ СТРАХОВОЕ ОБЩЕСТВО "ГЕОПОЛИС" "УТВЕРЖДАЮ" ООО СО "ГЕОПОЛИС" Генеральный директор Лицензия Центрального Банка ООО СО "Геополис" Российской Федерации СЛ № 2397 от 03.09.2015 г. Утверждены 30.05.2016г. Чхаидзе ПРАВИЛА ДО...»

«МЕЛЬНИКОВ ДЕНИС ГЕРМАНОВИЧ СИСТЕМАТИКА И ГЕОГРАФИЯ РОДА CLINOPODIUM L. (LAMIACEAE) ЕВРАЗИИ "Ботаника" 03.02.01 Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук профессор А. Л. Буданцев Санкт-Петербург Оглавление Введение Глава 1. Обз...»










 
2017 www.book.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.