WWW.BOOK.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные ресурсы
 
s

Pages:   || 2 | 3 |

«РАННИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ СОБЫТИЯ ФОРМИРОВАНИЯ МЕЗОДЕРМЫ У НЕРЕИДНЫХ ПОЛИХЕТ ...»

-- [ Страница 1 ] --

Санкт-Петербургский государственный университет

На правах рукописи

Козин Виталий Владиславович

РАННИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ СОБЫТИЯ ФОРМИРОВАНИЯ

МЕЗОДЕРМЫ У НЕРЕИДНЫХ ПОЛИХЕТ

03.03.05 – Биология развития, эмбриология

Диссертация

на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Научный руководитель

к.б.н., доцент

Костюченко Роман Петрович

Санкт-Петербург – 2017

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Формирование мезодермальных производных в индивидуальном и историческом развитии

1.1.1. Зародышевые листки и гаструляция

1.1.2. Появление мезодермы в ходе эволюции

1.1.3. Молекулярные механизмы миогенной дифференцировки

1.1.4. bHLH транскрипционный фактор Twist

1.1.5. Гомеодоменный транскрипционный фактор Mox

1.2. Развитие мезодермы у Spiralia

1.2.1. Клеточные линии и морфогенез мезодермы

1.2.2. Соматобласт 4d и организатор у Spiralia

1.2.3. Экспрессия молекулярно-генетических маркеров – возможных детерминантов развития мезодермы аннелид и моллюсков

1.3. Краткий обзор развития полихет как модельных объектов

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Использованная техника и материалы

2.2. Манипуляции с живыми объектами

2.3. Молекулярно-биологические методы

2.4. Анализ локализации белков и нуклеиновых кислот

Глава 3. Результаты

3.1. Анализ структурно-функциональной организации и экспрессии генов интереса

3.1.1. Twist

3.1.2. Mox

3.1.3. Evx

3.1.4. Vasa и PL10

3.1.5. Piwi

3.2. Разработка генетических методов прижизненного и функционального анализа

3.2.1. Трансгенез на основе транспозона Mos1

3.2.2. Трансгенез на основе рекомбинантной BAC

3.2.3. Мутагенез с помощью нуклеаз TALEN

3.3. Активность MAP-киназного сигналинга в эмбриогенезе

3.3.1. Выявление компонентов каскада MAP-киназ

3.3.2. Ингибиторный анализ

Глава 4. Обсуждение результатов

4.1. Молекулярные регуляторы развития мезодермы нереид и используемые методические подходы для их анализа

4.2. Ранняя экспрессия Twist в мезодермальных бластомерах

4.3. Молекулярное паттернирование мезодермы в ходе ларвального развития...... 142

4.4. Роль МАР-киназного сигналинга в формировании мезодермы

Выводы

Благодарности

Литература

Введение Актуальность и степень разработанности темы исследования Сегрегация зародышевых листков и спецификация клеточных линий являются одним из фундаментальных свойств многоклеточных животных. Эти события раннего развития во многом предопределяют и будущий план строения в целом и его более мелкие детали. Богатейший материал эмбриологических описаний на протяжении столетий служил доказательной базой для эволюционных построений. Поиск конкретных механизмов развития, начатый эмбриологами-экспериментаторами, во многом обеспечил прогресс молекулярной и клеточной биологии прошлого века.

Сегодня достижения молекулярно-генетической отрасли биологии делают возможным по-новому взглянуть на феномены индивидуального и исторического развития живых организмов. Стало возможным и чрезвычайно востребованным всестороннее изучение не только ограниченного числа модельных объектов, но и тех групп, в развитии которых существуют уникальные, а зачастую и парадоксальные закономерности.





К группе Spiralia в эмбриологическом понимании относят аннелид, моллюсков, немертин и плоских червей. В основном все они характеризуются стереотипным паттерном дробления с ранней сегрегацией зародышевых листков и клеточных линий, что внешне проявляется телобластическим способом формирования различных зачатков, в том числе и мезодермы. Потрясающий консерватизм развития спиралий состоит в гомологии расположения и судьбы многих бластомеров у зародышей дальнеродственных животных. Вместе с тем, на более поздних стадиях развития в ряду Spiralia наблюдается большое разнообразие, от паренхиматозных планарий с ресничной локомоцией до раковинных моллюсков, обладающих поперечнополосатыми мышцами. Даже в пределах типа Annelida развитие может включать стадию свободноживущей личинки трохофоры, превращающейся в процессе метаморфоза в ювенильного червя (как это происходит у “Polychaeta”) или быть прямым, когда из яйцевых оболочек вылупляется молодой червь, а не личинка (как у олигохет и пиявок – представителей Clitellata). Как объяснить это противоречивое сочетание внешне единообразного высоко детерминативного эмбриогенеза и разительно отличающихся взрослых форм? Решать этот актуальнейший вопрос следует не только на морфологическом и клеточном уровне, но и с привлечением современных молекулярно-генетических и функциональных методов анализа развития.

Spiralia (в современной макрофилогении – синоним клады Lophotrochozoa) являются крупнейшей, но до сих пор скудно изученной в генетическом аспекте ветвью Bilateria. Важнейшим эволюционным приобретением раннего развития трехслойных (=Bilateria) было обособление отдельного мезодермального листка. Молекулярной основой этой инновации считают вычленение миогенных факторов из общей мезэнтодермальной программы, приобретение ими самостоятельности и самодостаточности с последующей дивергенцией сложившейся мезодермальной генной регуляторной сети (Martindale, 2005; Козин, Костюченко, 2016). Как эволюционно более молодой, мезодермальный листок имеет наибольшую вариабельность в механизмах своего формирования в разных филогенетических линиях. Популярно мнение о том, что появление мезодермы в эмбриогенезе Bilateria во многом обеспечило взрывообразный рост числа планов строения тела в раннем кембрии (Martindale et al., 2004; Burton, 2008). Вместе с тем, такие принципиальные вопросы, как клеточные и молекулярные механизмы формирования мезодермы в эмбриогенезе и постларвальном развитии (при метаморфозе и регенерации) многих животных, пока не нашли решения. Тем важнее становится комплексное сравнительное изучение развития именно мезодермы, что должно приблизить к пониманию путей эволюции и создания современного биоразнообразия.

Клеткой-родоначальницей туловищной мезодермы (энтомезодермы) большинства спиралий является второй соматобласт – 4d. В результате равного деления 4d образуются два мезотелобласта, при пролиферации которых появляются билатерально-симметричные мезодермальные полоски. В основном, представления о характере пролиферации и формообразования энтомезодермы спиралий основываются на описаниях небольшого числа объектов с экстраполяцией на всю группу, что нельзя признать обоснованным в современных реалиях. В последние годы, с целью определения степени эволюционного консерватизма развития мезодермы, были детально изучены клеточные линии энтомезодермы у некоторых аннелид (Helobdella, Tubifex, Capitella, Platynereis) и моллюсков (Ilyanassa, Crepidula) (Rabinowitz et al., 2008; Meyer et al., 2010; Gline et al., 2011; Lyons et al., 2012; Fischer, Arendt, 2013).

Эти работы сделали еще более явными различия в раннем развитии мезодермы данных видов. Оказалось, что классические представления, изложенные в учебных руководствах, несводимы и неприложимы к большинству известных к сегодняшнему дню паттернов развития.

Кроме выяснения судьбы клеточных клонов и картирования зародышей Spiralia, в настоящий момент первостепенной задачей является идентификация конкретных участников программ развития, обеспечивающих спецификацию и последующее паттернирование зародышевых листков. Благодаря ряду разрозненных исследований, в производных энтомезодермы – мезодермальных полосках трохофоры – у моллюсков Haliotis и Ilyanassa была обнаружена дифференциальная экспрессия генов Mox, Nanos, Vasa, PL10 (Hinman, Degnan, 2002; Rabinowitz et al., 2008; Kranz et al., 2010), у полихеты Capitella – гомологов Twist, Hairy, Evx, Runx (Dill et al., 2007; Thamm, Seaver, 2008; Seaver et al., 2012), равно как Nanos и Vasa (Dill, Seaver, 2008). Большое внимание уделяется возможному участию MAP-киназного сигналинга и канонического Wnt/-катенинового пути в раннем развитии бластомеров с мезодермальной судьбой (Lambert, Nagy, 2001;

Henry, 2014). Подобные пионерные исследования очертили круг возможных молекулярных участников мезодермальной генной регуляторной сети у представителей Spiralia. Однако определенных закономерностей и очевидных гомологий пока выявить не удается, а порой противоречивость данных делает картину раннего развития спиралий еще более запутанной, чем казалось ранее. Очевидно, такая ситуация требует целенаправленного сравнительного изучения конкретных аспектов развития на ряде родственных объектов и более тщательный подбор новых модельных организмов.

Одной из успешно разрабатываемых моделей среди Spiralia являются нереидные полихеты (сем. Nereididae), которые дошли до наших дней в относительно малоизмененном состоянии и обладают множеством древних признаков.

Консервативными признаками, унаследованными от общего предка билатеральных животных, принято считать раннекембрийское происхождение, обитание в морской среде, план строения сегментированного тела, амфистомию, определенный набор семейств генов, соотношение паттернов их экспрессии и ряд особенностей организации генома. Нереид часто называют “живыми ископаемыми”, подчеркивая их преимущества над эволюционно продвинутыми, но тщательно проработанными в методическом плане модельными объектами – дрозофилой и Caenorhabditis elegans, которые независимо утратили некоторые древние признаки, сохранившиеся в измененном состоянии даже у позвоночных. Такая ситуация делает нереид более предпочтительным объектом для изучения в сравнительном аспекте. В этой связи относительно хорошо разработанными объектами среди полихет стали нереиды Platynereis dumerilii, Alitta virens (ранее – Nereis virens), Neanthes arenaceodentata (Fischer, Dorresteijn, 2004; Kulakova et al., 2007; Winchell et al., 2010). Для них созданы протоколы искусственного оплодотворения и получения культур развития, а также адаптированы современные методы выявления специфических белков и мРНК у зародышей. На P. dumerilii в последние годы начали применять технологии трансгенеза и мутационного анализа, которые естественно нуждаются в дальнейшем совершенствовании. Эти обстоятельства, а также успешный многолетний опыт работы кафедры эмбриологии ЛГУ/СПбГУ на нереидах предопределил выбор объектов данного исследования.

Цель и задачи исследования Цель работы – выявить клеточные и молекулярные основы развития мезодермы у Spiralia на примере нереидных полихет Alitta virens и Platynereis dumerilii.

Задачи:

1. Идентифицировать у нереид и описать структурно-функциональную организацию консервативных генов, участвующих в развитии мезодермы (гомологи Twist, Mox, Evx, Vasa, PL10, Piwi).

2. Изучить пространственно-временную экспрессию выделенных генов.

3. Подобрать для нереид новые методы прижизненного и функционального анализа генов интереса для дальнейшего изучения их роли в развитии мезодермы.

4. Раскрыть возможную роль MAP-киназного сигналинга в спецификации и морфогенезе мезодермы.

Научная новизна

Работа выполнена с привлечением широчайшего спектра современных методик, с совершенствованием и проверкой новых технических приемов.

Комплексный анализ проблемы достигнут сочетанием описательных морфологических, молекулярно-генетических и функциональных подходов. При этом во главу ставилась именно проблема ранней спецификации, паттернирования и морфогенеза мезодермы, а не анализ возможных молекулярных детерминантов и их активность на разнообразных стадиях онтогенеза. Интерпретация результатов дана в сравнительном и эволюционном аспектах на основе аналитического сопоставления исчерпывающей подборки литературных источников.

В настоящей работе у полихеты A. virens были обнаружены и впервые проанализированы фрагменты генов Twist, Mox, Evx, Vasa, PL10 и Piwi, гомолог Twist был также идентифицирован и отклонирован для P. dumerilii. Из просеквенированных участков кДНК и гДНК были восстановлены полноразмерные последовательности, содержащие 5’ UTR, ORF и 3’ UTR для генов Twist, Evx, Vasa, и Piwi. Протяженные последовательности Mox и PL10 остались неполными на 3’ конце. У обеих полихет было обнаружено по два паралогичных гена Piwi (Piwi1 и Piwi2), для остальных генов удалось найти по одному гомологу. Идентифицированные гены A. virens были названы Avi-twist, Avi-mox, Avi-evx, Avi-vasa, Avi-pl10, Avi-piwi1 и Avi-piwi2.

Впервые для Spiralia установлена панмезодермальная тканеспецифичность Twist (на стадии гаструлы A. virens). Циркумбластопоральная активность Twist, как у A. virens, не была показана в развитии ни одного из моллюсков и аннелид ранее. В совокупности со схожими данными, полученными на книдарии, брахиоподе и ланцетнике, наши результаты вносят принципиальный вклад в обоснование архицеломатной гипотезы возникновения мезодермы из края бластопора. Это положение подкрепляется метамерной экспрессией и Twist и нового для аннелид мезодермального маркера Mox у трохофор A. virens.

Среди эррантных полихет только в нашей работе для A. virens приведено описание экспрессии Evx, Vasa, PL10 и Piwi в мезодермальных зачатках. Подобная активность PL10 у спиралий ранее была выявлена лишь у одного вида моллюсков. В целом, проверенный набор регуляторных генов продемонстрировал высокую степень консерватизма мезодермальной тканеспецифичности среди Spiralia. Это позволяет нам с уверенностью включить проанализированные молекулярно-генетические факторы в состав анцестральной программы развития мезодермы спиралий. Изучение эволюционных преобразований этой программы является, по нашему мнению, отправной точкой для объяснения разнообразия уровней организации мезодермальных тканей Spiralia.

Выявленный паттерн ранней активности МАР-киназного сигналинга у A. virens разительно отличается от такового у других представителей Spiralia. Эти приоритетные данные для эррантных полихет говорят о коренных различиях в детерминации клеточных линий и вторичной оси тела у аннелид и моллюсков с гетероквадрантным спиральным дроблением. Ингибиторный анализ обнаружил новые критические периоды действия МАРК во время дробления A. virens. Предложенная модель многократной активации МАРК предполагает поэтапную детерминацию энтомезодермы. При этом впервые показано, что МАРК на стадиях дробления отвечает за гаструляционный морфогенез мезодермы, но не предопределяет образование мезодермального зачатка и его молекулярную разметку.

Достигнутый прогресс в методическом совершенствовании прижизненных и функциональных подходов к изучению регуляции развития мезодермы у P. dumerilii является важным и весьма востребованным результатом. В наших пионерных экспериментах по трансгенезу P. dumerilii была установлена необычная активность конструкций на основе транспозона Mos1, выражающаяся в вариабельности границ вырезания и встраивания трансгена с возможностью множественной интеграции различных фрагментов в один геномный локус. Это помогает объяснить невысокую эффективность трансгенеза P. dumerilii с использованием Mos1 и выбрать более перспективные технологии. Автором впервые проделан трансгенез с рекомбинантной ВАС, содержащей геномный локус A. virens, обеспечивший рекапитуляцию экспрессии гена интереса у P. dumerilii. Благодаря адаптации совершенно нового метода обратной генетики, получены TALEN-индуцированные мутации, дающие возможность проанализировать функцию Pdu-twist.

Теоретическая и практическая значимость работы Полученные результаты важны для понимания молекулярного профиля мезодермы у спиральных животных, путей приобретения мезодермальной идентичности и морфогенеза этого зачатка. Определение консервативных универсальных механизмов развития позволяет реконструировать общего предка анализируемых групп. Сравнение выявленных у нереид закономерностей с другими представителями первично- и вторичноротых делает возможным воссоздать облик Urbilateria – гипотетического предка всех трехслойных животных. Сделанные обобщения по этому поводу позволяют с большей надежностью различать плезиоморфные (древние) и апоморфные (продвинутые) признаки, а также описывать эволюционные события на уровне изменения активности генов и искать причины закрепления таких регуляторных состояний.

С практической точки зрения чрезвычайно ценны подобранные и усовершенствованные методы молекулярно-генетических манипуляций на нереидах.

Дальнейшие работы с применением трансгенеза и мутационного анализа, безусловно, будут более продуктивны с учетом представленных наработок. Последовательности впервые клонированных для A. virens и P. dumerilii генов загружены в базы данных, доступные для научного сообщества, и могут быть использованы для дальнейшего анализа молекулярной эволюции семейств соответствующих генов. Результаты исследования используются в учебном процессе на биологическом факультете СПбГУ.

Изложенные и опубликованные данные включены в лекционные курсы по эволюционной биологии развития и эмбриологии. Препараты экспрессии генов служат методическим материалом на практических занятиях, демонстрирующих молекулярную природу дифференцировки мезодермы и генетическую обусловленность процессов развития.

Методология и методы исследования Был применен как описательный, так и экспериментальный подход.

Наблюдения проводили на живом и фиксированном материале развития. Для этого по протоколу искусственного оплодотворения получали синхронные эмбриональные культуры Alitta virens (от производителей дикого типа) и Platynereis dumerilii (от животных дикого типа, а также из инбредных и трансгенных линий). В зиготы P.

dumerilii с помощью микроинъекций доставляли различные мРНК и ДНК. При фиксации стадий развития использовали сотни объектов. Выявление специфических эндогенных белков и мРНК в клетках зародышей и личинок проводили на тотальных препаратах по протоколу иммуноцитохимии и молекулярной гибридизации in situ (whole mount in situ hybridization, WMISH).

Среди молекулярно-биологических методик использовали: выделение мРНК, обратную транскрипцию, клонирование генов, рестрикционный анализ, блоттинг и гибридизацию по Саузерну, транскрипцию in vitro, конструирование репортерных трансгенов и сайт-специфических нуклеаз TALEN, рекомбинацию бактериальных искусственных хромосом (ВАС), проверку активности транспозазы в клетках зародышей. Среди различных вариантов полимеразной цепной реакции (ПЦР) были ПЦР со специфическими праймерами на кДНК и гДНК, вырожденная ПЦР, гнездовая ПЦР, тачдаун-ПЦР (touchdown PCR), полуколичественной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР, RT-PCR), TAIL-ПЦР (Thermal Asymmetric Interlaced PCR).

Широкое применение получили методы анализа in silico, включая моделирование филогенетических схем, предсказание структуры генетических локусов, аннотирование последовательностей мРНК и белков.

Для оценки значимости молекулярных событий применяли методологию “утрата функции” (loss-of-function). МАР-киназный сигналинг подавляли фармакологическим агентом U0126. Зародышей инкубировали в растворе ингибитора и анализировали результаты прижизненно, а также с помощью гибридизации in situ, морфометрии и статистической обработки. Нокаут гена Pdu-twist проводили с помощью TALEN-индуцированного мутагенеза.

Положения, выносимые на защиту

1. В геномах нереид A. virens и P. dumerilii присутствуют консервативные для Spiralia мезодермальные регуляторные факторы – гомологи генов Twist, Mox, Evx, Vasa, PL10, Piwi.

2. Эти факторы дифференциально экспрессируются в ходе эмбрионального и личиночного развития A. virens, придавая мезодермальным клеткам уникальное регуляторное состояние.

3. На стадиях дробления у нереид выявлены активные компоненты МАРкиназного сигнального пути, которые важны для морфогенеза мезодермальных полосок.

4. Впервые опробованные на P. dumerilii генетические методы (трансгенез и мутагенез) и сформулированные методические рекомендации открывают качественно новые возможности исследования мезодермы у Spiralia.

Степень достоверности и апробация результатов Результаты и выводы работы имеют высокую степень достоверности, поскольку получены с помощью комплекса разных методов на двух объектах (A. virens и P.

dumerilii) с применением повторностей, контролей и статистической обработки.

Журнальные публикации автора прошли тщательное рецензирование и активно цитируются.

Полученные данные опубликованы в 12 работах. Из них 4 статьи в специализированных изданиях (“Известия РАН. Серия биологическая”, “Mechanisms of Development”, “Development Genes and Evolution”, “PLoS ONE”), рекомендованных ВАК и индексируемых WoSCC и Scopus, в том числе 3 на английском языке, и 8 тезисов конференций. Автором работы были сделаны устные доклады на III Конференции молодых ученых Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2012 г.), на Всероссийской конференции с международным участием “Эмбриональное развитие, морфогенез и эволюция” (Санкт-Петербург, 2013 г.), на Международном V съезде Европейского Общества Эволюционной Биологии Развития (Вена, Австрия, 2014 г.), на Всероссийской конференции “Морфогенез в индивидуальном и историческом развитии: устойчивость и вариабельность” (Москва, 2015 г.), на III Всероссийской конференции с международным участием “Современные проблемы эволюционной морфологии животных” (Санкт-Петербург, 2016 г.), а также на научных семинарах кафедр эмбриологии и зоологии беспозвоночных биологического факультета СПбГУ.

Стендовые доклады представлялись на Международной конференции “Современные методы микроскопии в биологии и медицине” (Санкт-Петербург, 2009 г.), на Международной научной конференции “Каспар Фридрих Вольф и современная биология развития” (Санкт-Петербург, 2009 г.), на Международном IV съезде Европейского Общества Эволюционной Биологии Развития (Лиссабон, Португалия, 2012 г.).

Глава 1. Обзор литературы Сегрегация зародышевых листков и спецификация клеточных линий являются одним из фундаментальных свойств многоклеточных организмов.

Эти события раннего развития во многом предопределяют и будущий план строения в целом и его более мелкие детали. Уже во второй половине 20-го века начавшийся синтез экспериментальной эмбриологии и генетики привел к выводу, что определение клеточной судьбы в эмбриогенезе обусловливается изменениями дифференциальной экспрессии генов в различных клеточных линиях развивающегося зародыша (Davidson, 1976; Raff, Kaufman, 1983).

Развитие (в норме) сопровождается прогрессивным ограничением клеточных потенций. Недифференцированные клетки последовательно претерпевают спецификацию (обратимое состояние), детерминацию (необратимое изменение) и специализацию (терминальная дифференцировка). Спецификация клетки может быть уточнена в ходе развития, когда сначала определяется судьба всего морфогенетического поля – группы клеток, дающих определенный зачаток, – а впоследствии в его составе сформируются различные клеточные типы. В случае изоляции или пересадки еще недетерминированной клетки, ее судьба может быть легко изменена под влиянием окружения. Будучи помещенной в нейтральные условия, такая клетка дифференцируется в соответствии с первоначально приобретенной спецификацией. Детерминация же является, как правило, необратимым состоянием и определяет будущую судьбу клетки независимо от внешних условий. Первые этапы предопределения клеточной идентичности – спецификацию и детерминацию – часто объединяют под термином коммитирование (Stern, 2004; Gilbert, 2006). В отличие от коммитированных, дифференцированные клетки приобретают морфологические (в том числе ультраструктурные) отличия, поскольку они синтезируют определенные молекулы и уникальные субклеточные структуры, необходимые для выполнения функции, например, миофибриллы у мышц, нейромедиаторы у нейронов, жгутики у сперматозоидов.

Основными феноменами развития, помимо цитодифференциации, являются пространственное паттернирование (региональная спецификация) и морфогенез (формообразование) (Wolpert, 1969; Slack, 2005; Дондуа, 2005). Последние два явления обеспечивают создание организованного трехмерного зародыша, оси и зачатки которого упорядочены в пространстве.

В данной главе будут изложены классические представления о механизмах развития и современное состояние проблемы формирования мезодермы в онтогенезе и эволюции. Кроме того, будут охарактеризованы важнейшие аспекты биологии развития нереидных полихет, послуживших объектом данного исследования.

1.1. Формирование мезодермальных производных в индивидуальном иисторическом развитии

1.1.1. Зародышевые листки и гаструляция В ходе гаструляции начинается закономерное преобразование пространственной структуры зародыша – выделяются крупные клеточные домены, называемые зародышевыми листками. Еще до начала гаструляции, на стадии поздней бластулы, материал зародышевых листков принято обозначать в виде карты презумптивных зачатков. Поскольку клетки бластулы, в принципе, могут изменить свою судьбу, если, к примеру, их пересадить в новое морфогенетическое поле, то до начала гаструляции следует говорить именно о презумптивных зародышевых листках (Hall, 1998). Сами зародышевые листки являются зачатками комплексов тканей и органов.

Согласно “принципу специфичности” одноименные зародышевые листки у разных животных обладают одинаковым набором производных. Наружный листок (эктодерма) дает начало покровам тела и нервной ткани, внутренний (энтодерма) – пищеварительной системе. Мезодерма, или средний зародышевый листок, дифференцируется в ткани внутренней среды, мышцы и целомический эпителий.

Правильное инвариантное взаиморасположение внешнего, внутреннего и среднего (промежуточного) листков после прохождения гаструляции отвечает “принципу топографии” (Иванова-Казас, 1995; Козин, Костюченко, 2016).

Согласно теории зародышевых листков у двухслойных (книдарий и гребневиков) существует два листка – наружный эктодермальный и внутренний энтодермальный (Рис. 1). Иногда последний обозначают англ. термином “endomesoderm” (Stern, 2004;

Martindale, 2005; Rttinger et al., 2012), что соответствует русскоязычному понятию “мезэнтодерма” – общий зачаток мезодермальных и энтодермальных структур.

Мезэнтодермой также можно назвать зачаток паренхимы Acoela (Иванова-Казас, 1995).

У остальных эуметазойных животных выделяют все три листка, отсюда и название трехслойные. Хотя, и у первично-, и у вторичноротых в раннем развитии почти всегда есть бипотенциальный мезэнтодермальный зачаток с консервативными механизмами спецификации (Rodaway et al., 1999; Rodaway, Patient, 2001).

Рис. 1. Гаструла двухслойных (слева) и трехслойных животных (справа) (по Martindale, 2005). Эктодерма обозначена голубым, энтодерма – желтым, мезодерма – красным, звездочка – бластопор.

В соответствии с классической точкой зрения формирование зародышевых листков в раннем онтогенезе Eumetazoa имеет важное филогенетическое значение, которое состоит в рекапитуляции онтогенеза далеких предков, обусловленной сохранением (консервацией) древнейших участков программы развития (ИвановаКазас, 1995). Появление мезодермального листка у трехслойных предполагает серьезное преобразование старой мезэнтодермальной программы, основанное на вычленении миогенных факторов из общей сети и дальнейшей дивергенции этих участков программы (Martindale, 2005). Кроме того, мезодермальные клетки могут быть дополнительно индуцированы в новом месте зародыша (Rodaway, Patient, 2001).

Морфологическое обособление мезодермы в ходе гаструляции может осуществляться в основном двумя альтернативными способами – телобластическим или энтероцельным (Рис. 2). Первый из них ярчайшим образом реализуется у аннелид и ракообразных, в развитии которых очень рано детерминируются бластомеры мезодермальной линии. Пролиферация этих мезодермальных телобластов дает начало мезенхимным скоплениям, внутри каждого из которых схизоцельно образуется полость. Окружающие полость клетки выстраиваются в эпителий, образуя целомический мешок. При энтероцельном способе, в чистом виде представленном у иглокожих и полухордовых, в определенных участках архентерона образуются выпячивания, и первичные целомы отпочковываются внутрь бластоцеля. Далее первичные целомы разделяются перешнуровкой на характерное для данного вида количество целомических мешков.

Рис. 2. Пути формирования мезодермы (показана красным цветом) у ресничных личинок первично- и вторичноротых животных (по Technau, Scholz, 2003).

Интереснейшим вопросом является молекулярно-генетический и клеточный механизм описанных морфогенезов. Несомненно, активность телобластов и энтероцелия опираются на совершенно различные типы клеточного поведения (пролиферация, миграция, мезенхимно-эпителиальный переход отдельных клеток с одной стороны и апикальное сжатие, перестройка клеточных контактов в эпителии – с другой). Тем не менее, результатом являются гомологичные образования – расположенные между кишкой и кожей мезодермальные сомиты, дающие начало мышцам стенки тела и целомической выстилке.

1.1.2. Появление мезодермы в ходе эволюции Как морфологические и эмбриологические, так и молекулярные данные указывают на то, что древнейшими мезодермальными производными были мышечные клетки (Rieger, Ladurner, 2003; Martindale, 2005; Schmidt-Rhaesa, 2007;

Chiodin et al., 2013). Первичной функцией миоцитов могли быть контроль за направлением движения и обеспечение гибкости тела во время плавания и скольжения по субстрату (Козин, Костюченко, 2016; Rieger, Ladurner, 2003). Прототипом подобного примитивного организма с ресничной локомоцией служат базальные Bilateria, такие как Acoelomorpha. Миоциты у Nemertodermatida и Acoela имеют мезэнтодермальное происхождение, выделяясь из состава кишечного эпителия (Henry et al., 2000; Rieger, Ladurner, 2003). Свободные мышечные клетки, как полагают многие современные авторы, произошли в эволюции от миоэпителия, широко встречающегося у книдарий, первично- и вторичноротых (Rieger, Ladurner, 2003; Seipel, Schmid, 2005;

Schmidt-Rhaesa, 2007; Arendt, 2008; Burton, 2008). У полипов и медуз миоэпителиальные клетки присутствуют в составе эпидермиса и гастродермиса, у билатеральных – полностью или частично слагают целомическую выстилку (Seipel, Schmid, 2006; Schmidt-Rhaesa, 2007). На основе сравнительно-микроанатомических исследований не раз высказывалось мнение о плавной эволюционной трансформации однородного миоэпителия в стратифицированный, у некоторых клеток которого сократительный аппарат смещался базально и/или выносился за пределы пласта, а позднее эти клетки и вовсе выселялись из эпителия, давая начало отдельным мышечным волокнам, прилежащим к стенке целома (Рис. 3). Такие морфологические ряды построены, например, для иглокожих (Rieger, Lombardi, 1987) и аннелид (Bartolomaeus, 1994).

Рис. 3. Предполагаемые пути эволюционной трансформации миоэпителия (по SchmidtRhaesa, 2007). Анцестральное состояние показано вверху, переходные варианты – посередине, эволюционно-продвинутая тканевая организация – внизу.

Поскольку гистологическая организация и стадия формирования целомического эпителия в развитии аннелид сильно варьируют, следует признать возможность независимого и многократного происхождения отдельного от мышц перитонеального листка даже в пределах этого типа животных (Rieger, Purschke, 2005). По сходным причинам другие мезодермальные производные, например соединительную ткань, также считают вторично приобретенной по сравнению с мышцами (Rieger, Ladurner, 2003). Это предположение ярко демонстрируют Acoelomorpha, у которых периферическая паренхима развивается и в онто- и в филогенезе из кишечного эпителия уже после формирования мускулатуры (Hejnol, Martindale, 2008).

Древнейшее происхождение мышечного типа клеток подтверждают и молекулярно-генетические данные. Путем широкомасштабного биоинформационного скрининга в секвенированных геномах ряда протистов, растений, грибов и многоклеточных животных были идентифицированы гены ключевых элементов сократительного аппарата мышечных клеток (Козин, 2013a; Steinmetz et al., 2012).

Оказалось, что среди этих генов общим для многоклеточных животных, грибов и некоторых протистов является набор из актина, тяжелой и легкой цепи миозина, тропомиозина и кальмодулина. На основе этого консервативного набора генов и началась эволюция мышечных клеток. Кроме того, Steinmetz и др. (2012) установили, что дивергенция “мышечного” и “немышечного” типа тяжелой цепи миозина произошла еще до появления Metazoa. Наконец, было показано, что в разных линиях многоклеточных животных, несмотря на сходство поперечно-полосатых мышц на ультраструктурном уровне (Schmidt-Rhaesa, 2007), набор ключевых белков в составе саркомеров сильно варьирует, что, несомненно, указывает на независимую эволюцию этих мышечных элементов у Diploblastica, Protostomia и Deuterostomia (Steinmetz et al., 2012).

У гребневиков мышечные клетки существуют исключительно в виде отдельных миоцитов (Schmidt-Rhaesa, 2007). Эти гладкомышечные элементы мезоглеи, глотки и щупалец ведут свое происхождение от нескольких линий бластомеров, отделяющихся в ходе дробления, от энтодермальных клеток (Martindale, Henry, 1999). У одного из отрядов гребневиков также обнаружены поперечно-полосатые мышцы, ультраструктура которых значительно отличается от таковой у трехслойных (SchmidtRhaesa, 2007). Эти факты позволяют некоторым авторам говорить о существовании у гребневиков настоящего мезодермального листка (Martindale, 2005; Nielsen, 2008).

Однако филогения и молекулярные данные свидетельствуют об обратном. В развитии гребневиков пока не обнаружено экспрессии ранних мезэнтодермальных маркеров, специфичной исключительно для миогенной линии (Yamada et al., 2007). Более того, в геномах гребневиков отсутствуют важнейшие игроки мезодермальной программы трехслойных, такие как Twist, GATA, NK, Nodal, MyoD (Ryan et al., 2013). В связи с этим, следует признать независимое происхождение мезодермы Bilateria и миогенной клеточной линии Ctenophora.

Тканевая и молекулярно-генетическая организация книдарий в отношении мезодермальной проблематики сильно отличается от описанной картины у гребневиков. Занимающие базальное среди книдарий филогенетическое положение Anthozoa располагают мышцами только в миоэпителиальном виде (Schmidt-Rhaesa, 2007; Burton, 2008). В большинстве случаев эти мышцы гладкие, но в одном из семейств (у сильно вторично измененных плавающих актиний) встречаются поперечнополосатые мышечные клетки (Burton, 2008). Напротив, у книдарий с медузоидной стадией (сцифоидных, кубомедуз и гидроидных) наравне с гладкомышечными широко распространены волокна и пласты из поперечно-полосатых клеток как эпителиальномышечной природы, так и вынесенные из эпителиального слоя (Seipel, Schmid, 2006).

Большой интерес представляет уникальная для гидроидов структура, известная как энтокодон. Энтокодон формируется в медузоидной почке у полипа или реже – медузы за счет дедифференцировки, пролиферации и погружения эктодермальных клеток под эпидермис (Ball et al., 2004; Seipel, Schmid, 2005; Schmidt-Rhaesa, 2007). Так, энтокодон оказывается третьим слоем почки, заключенным между энто- и эктодермальным эпителием. В ходе дифференцировки из энтокодона образуется вся поверхность субумбреллы медузы, включая поперечно-полосатые и гладкомышечные элементы. Неудивительно, что развитие энтокодона сопровождает экспрессия миогенных факторов MyoD и Mef2 (Seipel, Schmid, 2005). Однако мезодермальные регуляторы более высокого порядка, такие как Twist и Brachyury экспрессируются очень непродолжительно и не только в клетках энтокодона (Spring et al., 2000; Seipel, Schmid, 2005). Примечательно, что в ходе эмбриогенеза и у личинок локализация мРНК обозначенных мезодермальных факторов, а также GATA у актинии Nematostella, приурочена к проспективной энтодерме (Martindale et al., 2004; Seipel, Schmid, 2005), тогда как энтокодон развивается из эктодермальных клеток. Кроме того, в отличие от настоящей мезодермы энтокодон образуется в ходе почкования, а не при гаструляции.

Вкупе с известным филогенетическим положением Hydrozoa это дает основание Шмидт-Рэше (Schmidt-Rhaesa, 2007) и Бёртону (Burton, 2008) отвергнуть гипотезу гомологии энтокодона и мезодермы трехслойных, утверждающую существование последней у общего предка Eumetazoa (Seipel, Schmid, 2005).

При рассмотрении примитивнейших базальных билатеральных животных – Acoela – оказывается, что их миогенез по всем параметрам соответствует мезодермальной программе трехслойных, выделенной из мезэнтодермальной сети (Henry et al., 2000; Rieger, Ladurner, 2003; Martindale, 2005; Hejnol, Martindale, 2008). По последним данным, тканеспецифично у Acoela экспрессируются и структурные, и регуляторные компоненты миогенеза (Chiodin et al., 2011; Chiodin et al., 2013): 12 мезодермальных маркеров выявлены в небольшом количестве перекрывающихся доменов, что свидетельствует о малом разнообразии мышечных клеток.

Анализ развития низших Eumetazoa позволяет нам (Козин, Костюченко, 2016) вслед за рядом авторов (Technau, Scholz, 2003; Ball et al., 2004; Martindale et al., 2004;

Burton, 2008) утверждать, что 1) “мезодермальные” гены возникли раньше мезодермы;

2) у двухслойных они участвовали в развитии энтодермы; 3) мезодермальный листок появился в ходе эволюции за счет сегрегации группы клеток в области бластопора (центра гаструляции); 4) первичной мезодермальной дифференцировкой были мышечные элементы; 5) свободные миоциты и поперечно-полосатые мышцы адаптивно возникали в эволюции несколько раз, что в ряде случаев происходило на фоне отсутствия мезодермального зародышевого листка.

1.1.3. Молекулярные механизмы миогенной дифференцировки Транскрипционная регуляция миогенеза – формирования скелетных мышц позвоночных и мышечной стенки тела у беспозвоночных – стала одной из ключевых модельных генных регуляторных сетей, начиная со времен открытия белковых факторов MRF (myogenic regulatory factors) (Козин, Костюченко, 2016). Молекулы MRF представляют собой транскрипционные факторы суперсемейства bHLH (basic helix– loop–helix) и обладают замечательной способностью трансформировать немезодермальные производные, такие как меланобласты, гепатобласты или нейробласты в мышечные клетки (Weintraub et al., 1989). Это свойство, вкупе с их исключительной важностью для нормального развития мышц, делает MRF настоящими мастер-генами миогенеза (Tapscott, 2005; Ciglar, Furlong, 2009; Comai, Tajbakhsh, 2014).

У позвоночных существует 4 паралогичных MRF (Рис. 4): MyoD, Myf5, Mrf4, участвующие в спецификации миобластов, и MyoG (Myogenin), обеспечивающий дифференцировку миобластов (Bentzinger et al., 2012; Buckingham, Rigby, 2014).

Рис. 4. Базовая миогенная программа развития (the core myogenic network) у позвоночных, дрозофилы и нематоды C. elegans (по Ciglar, Furlong, 2009).

Гомологичные факторы из одного семейства обозначены шрифтом одинакового цвета (bHLH – зеленый, Eya/Six – оранжевый, MADS/SRF – красный). Вверху (синяя заливка) – внешние по отношению к мезодермальным клеткам сигнальные молекулы.

Посередине (зеленая заливка) – модуль спецификации. Внизу (розовая заливка) – участники этапа терминальной дифференцировки. Установленные межгенные взаимодействия показаны стрелками.

Напротив, у дрозофилы мастер-регулятором миогенеза считается другой bHLH транскрипционный фактор – Twist, поскольку он необходим и достаточен для запуска программы развития мышц (Baylies, Bate, 1996; Furlong, 2004; Barnes, Firulli, 2009). В отличие от MRF позвоночных Twist у насекомых имеет гораздо более широкие функции в развитии мезодермы (Castanon, Baylies, 2002; Handel et al., 2005). У дрозофилы Twist отвечает за спецификацию и паттернирование мезодермы, ее гаструляционный морфогенез, спецификацию и дифференцировку разных мышечных линий, включая предшественники эмбриональных и взрослых мышц стенки тела (Leptin, 1991; Baylies et al., 1998; Ciglar, Furlong, 2009; Joussineau de et al., 2012). Молекулярные механизмы такой разнообразной специфичности, как было недавно установлено (Sandmann et al., 2007; Wong et al., 2014), состоят в возможности прямого взаимодействии белка Twist с энхансерами (имеющими различную чувствительность к его концентрациям) сотен регуляторных генов, включая tinman. Гомеодоменный ТФ Tinman (гомолог Nkx2.5) считается вторым по значимости для миогенеза у дрозофилы и ответственен за формирование сердца и дорсальной мускулатуры (Ciglar, Furlong, 2009).

Единственный гомолог генов MRF у дрозофилы называется nautilus, который наиболее близок по первичной последовательности (ортологичен) гену MyoD.

Динамика его экспрессии и роль в нормальном развитии весьма похожа на свойства MRF позвоночных (Abmayr, Keller, 1997; Wei et al., 2007; Enriquez et al., 2012). Nautilus также обладает истинной активностью мастер-регулятора миогенеза, поскольку способен наделить культуру клеток миогенной судьбой, а его эктопическая экспрессия во всей мезодерме зародыша достаточна для превращения кардиобластов в мышцы стенки тела (Ciglar, Furlong, 2009). Хотя регуляция транскрипции nautilus со стороны Twist не была специально исследована, факт того, что она запускается много позже начала экспрессии twist и tinman позволяет предположить, что nautilus подчинен этим ТФ в сети (Рис. 4).

У нематоды Caenorhabditis elegans ортологом MyoD является HLH-1. Он достаточен для запуска миогенеза в различных линиях ранних бластомеров, однако нокаут HLH-1 ведет к морфо-функциональным нарушениям мышц стенки тела, но не останавливает их спецификацию (Fukushige, Krause, 2005). Это противоречие было решено исследованием (Fukushige et al., 2006), показавшим, что функция HLH-1 частично пересекается с функциями двух других мезодермальных регуляторов – UNCMADS-бокс содержащий транскрипционный фактор, родственный SRF позвоночных) и HND-1 (представитель суперсемейства bHLH белков Hand). Делеция всех трех генов приводит к полной утрате соматической мускулатуры. Сходным образом MyoD, Myf5 и Mrf4 обладают частично перекрывающимися функциями в инициации миогенеза у мыши (Ciglar, Furlong, 2009).

Вышестоящими регуляторами генов MRF у позвоночных являются транскрипционные факторы Pax3/7, Six1/4, Eya1/2, а также сигнальные пути Wnt, Hedgehog и BMP (Рис. 4). В отличие от MRF гены Pax семейства не являются тканеспецифичными для параксиальной мезодермы, экспрессируясь также в нейроэктодерме, участках нервной трубки и нервном гребне (Buckingham, Rigby, 2014).

В пределах мезодермы Pax3 активен в сегментационной пластинке, эпителиальных сомитах, дермомиотоме дифференцированных сомитов и мигрирующих миогенных клетках-предшественниках (прогениторах), обеспечивая их жизнеспособность и пролиферацию (Bentzinger et al., 2012; Buckingham, Rigby, 2014). Pax3 напрямую может активировать Myf5, продукт которого в свою очередь положительно регулирует транскрипцию MyoD. У мыши множественная мутация Pax3/Myf5(/Mrf4) ведет к неразвитию всех скелетных мышц туловища и конечностей, при этом отсутствует транскрипция и MyoD, и других нижестоящих (подчиненных) факторов миогенеза (Tajbakhsh et al., 1997). С другой стороны, Pax7 проявляет свою активность позже, обнаруживаясь в центральном домене дермомиотома и происходящих из него миогенных прогениторах на фетальных стадиях. Pax7 также является необходимым для поддержания популяции стволовых клеток мышечной ткани (клеток-сателлитов).

Генетический анализ говорит о том, что Pax3 и Pax7 являются во многом взаимозаменяемыми факторами, появившимися у позвоночных в результате дупликации анцестрального гена (Bentzinger et al., 2012). Тем не менее, специфичный для мезодермы дрозофилы Poxm стоит гораздо ниже в иерархии миогенных регуляторов, и его нокаут дает слабый фенотип с небольшими дефектами в некоторых группах вентральных и латеральных мышц (Ciglar, Furlong, 2009).

Six1 и Six4 считаются у позвоночных важнейшим звеном в определении судьбы клеток дермомиотома по миогенному пути (Bentzinger et al., 2012). В комплексе с Eya1 и Eya2 белки Six активирую в ядре транскрипцию Pax3, MyoD, Mrf4, Myogenin (Grifone et al., 2005). Как и к гомологам MRF и Pax, к парам Six1 и Six4, Eya1 и Eya2, применимо правило частичной взаимозаменяемости, поскольку одиночные мутации (в отличие от двойных Six1/Six4 или Eya1/Eya2) приводят лишь к незначительным дефектам (Grifone et al., 2005; Bentzinger et al., 2012). У дрозофилы Six и Eya (Eyes absent) были описаны как главнейшие регуляторы развития глаз, но также вовлечены и в процессы миогенеза. Оба гена экспрессируются в мезодерме зародыша дрозофилы под контролем Tinman, а их мутации ведут к отсутствию нужных и эктопическому появлению дополнительных мышц (Clark et al., 2006). В связи с этим Six и Eya определяют как достаточно низко стоящие компоненты миогенной сети насекомых (Ciglar, Furlong, 2009).

И у позвоночных, и у дрозофилы мастер-генами миогенеза (MRF и Twist) позитивно и негативно управляют паракринные сигнальные молекулы Wnt, Hedgehog и BMP/dpp семейств (Ciglar, Furlong, 2009; Bentzinger et al., 2012). Примечательно, что источником сигнала чаще всего служат немезодермальные ткани. Характерным для развития мезодермального зачатка насекомых является регуляция со стороны сигнального пути NF-B. Материнский ТФ Dorsal (гомолог NF-B) напрямую запускает зиготическую экспрессию twist, которая затем поддерживается как автокаталитически, так и с помощью механотрансдукции и -катенина (Jiang et al., 1991; Sandmann et al., 2007; Brunet et al., 2013). Аналогичным образом NF-B позитивно регулирует экспрессию Twist у зародышей Xenopus (Zhang, Klymkowsky, 2009).

За паттернирование миогенного материала в разных частях зародыша позвоночных ответственны ТФ из семейств Pitx, Lbx, Msx, Sim, Mox, Tbx, Lhx и др.

(Buckingham, Rigby, 2014; Comai, Tajbakhsh, 2014). В определении идентичности миобластов дрозофилы участвуют т.н. iTF (muscle identity transcription factors): Eve, S59, Kr, Msh, Col, Ap, Runt, Lb, Lms, Nau, Poxm, Vg, Sd, D-Ptx1, Tey (Joussineau de et al., 2012).

Завершающей стадией миогенеза является терминальная дифференцировка, при которой миоциты сливаются в миофибриллы, появляется специфический сократительный аппарат и нервно-мышечные окончания. У подавляющего большинства исследованных животных главнейшим драйвером этого процесса служит MADS-бокс содержащий ТФ Mef2 (Sandmann et al., 2006; Ciglar, Furlong, 2009).

Энхансеры Mef2 являются прямой мишенью факторов MRF (прежде всего MyoD) позвоночных и Twist дрозофилы, что обеспечивает довольно ранний запуск экспрессии Mef2 (Cripps et al., 1998). Сам Mef2 положительной обратной связью поддерживает транскрипцию указанных миогенных спецификаторов, что еще больше амплифицирует сигнал и стабилизирует выбранный путь дифференцировки (Potthoff, Olson, 2007).

Кроме того, Mef2 активирует в миоцитах множество структурных генов, таких как специфичные для мышц актины, миозины, тропомиозины и т.д. (Potthoff, Olson, 2007;

Comai, Tajbakhsh, 2014). Эктопически запустить миогенез Mef2 неспособен, что говорит о необходимости кооперации с другими регуляторами, в частности – с гомологами MRF, CF2 и Twist, последний из которых может физически взаимодействовать с Mef2 и имеет с ним соседствующие цис-регуляторные участки в энхансерах подчиненных генов (Sandmann et al., 2007).

При использовании серии мутированных аллелей (Elgar et al., 2008) было показано, что подавление активности Mef2 у дрозофилы блокирует слияние миоцитов и экспрессию поздних маркеров миодифференцировки в доза-зависимой манере.

Нокдаун генов Mef2 у позвоночных ведет к сходным (хотя и менее катастрофическим из-за наличия нескольких паралогов с перекрывающимися функциями) последствиям – дезорганизации сократительного аппарата и деградации миофибрилл (Hinits, Hughes, 2007). Примечательно, что в случае оверэкспрессия Mef2 преждевременной миодифференцировки не происходит, что подчеркивает его роль именно в созревании и поддержании нормальной организации саркомеров (Potthoff, Olson, 2007).

Подводя итог анализу миогенной программы развития, вслед за Сиглар и Фурлонг (Ciglar, Furlong, 2009) можно отметить (Козин, Костюченко, 2016), что набор ее участников (классов регуляторных и структурных генов) в основном стабилен даже у дальнеродственных Bilateria, но топология сети и специфичность гомологичных факторов эволюционировали в разных линиях самостоятельно (Рис. 4).

“Мезодермальные” bHLH факторы (паралоги MRF в совокупности и Twist) занимают аналогичное положение в программе миогенеза позвоночных и Ecdysozoa, запуская большое количество батарей генов с разнообразным функционалом от пролиферации до метаболизма и биогенеза сократительного аппарата. Регуляторная ось MyoD-Mef2 и Twist-Mef2 вместе с нижележащими модулями также демонстрирует определенную степень консерватизма в сравнении программ мыши и дрозофилы.

1.1.4. bHLH транскрипционный фактор Twist Одним из важнейших участников программы развития мезодермы у трехслойных животных является транскрипционный фактор Twist. Он функционирует на этапах спецификации мезодермы и играет ключевую роль в этом процессе у некоторых Ecdysozoa и Deuterostomia. Именно поэтому гомолог Twist был избран для подробного рассмотрения в связи с проблемой происхождения и развития мезодермы у полихет. Следует отметить, что у разных групп многоклеточных гомологи Twist активны на несколько отличающихся этапах развития, в связи с чем анцестральная функция Twist остается не вполне ясной. Для установления возможной роли Twist в развитии мезодермы у изученных нами объектов (раздел 3.1.1) рассмотрим некоторые аспекты функционирования транскрипционного фактора Twist и его гомологов у разных представителей Metazoa.

История открытия Впервые ген twist был описан у Drosophila melanogaster (Simpson, 1983; NssleinVolhard et al., 1984). Мутация по этому гену приводила к очень ранним нарушениям в развитии и была летальной. Во время гаструляции у мутантных гомозигот по twist не формировалась вентральная борозда и, как следствие, отсутствовала мезодерма. Сами мутанты были частично дорсализованы. Фенотип twist -/- был схож с фенотипом мутации по гену материнского эффекта dorsal, являющегося ключевым участником спецификации дорсовентральной оси. Таким образом, первой предполагаемой функцией гена twist стало участие в определении дорсовентральной полярности (Thisse et al., 1987a).

Затем были установлены паттерны экспрессии twist на уровне мРНК (Thisse et al., 1987b) и белка (Thisse et al., 1988). Оказалось, что twist начинает экспрессироваться на стадии синцитиальной бластодермы в презумптивной мезодерме и зачатках передней и задней кишки. Результаты иммуноцитохимического выявления белкового продукта twist показали его ядерную локализацию и позволили предположить, что Twist является транскрипционным фактором. С учетом того, что мутация по twist блокировала интернализацию презумптивной мезодермы, но не нарушала первые этапы морфогенеза передней и задней кишки (их инвагинация происходила), была высказана гипотеза о том, что twist выполняет функцию спецификатора мезодермы (Thisse et al., 1988).

Дальнейший мутационный анализ показал, что twist является первым зиготическим геном каскада, контролирующего развитие мезодермы у дрозофилы (Leptin, 1991). Поскольку процесс интернализации мезодермы у дрозофилы является примером эпителиально-мезенхимного перехода, возможными мишенями twist были названы гены, которые контролируют клеточную адгезию и/или клеточную миграцию и участвуют в образовании вентральной борозды при гаструляции (Thisse et al., 1988;

Leptin, Grunewald, 1990).

Участие в эпителиально-мезенхимном переходе при канцерогенезе Интенсивно изучаемый в настоящее время пример эпителиально-мезенхимного перехода – метастазирование злокачественных опухолей.

Не так давно было обнаружено, что гомологи Twist у млекопитающих являются ключевыми участниками этого процесса (Kang, Massagu, 2004; Yang et al., 2004). Оказалось, что в опухолевых клетках активность гомологов Twist приводит к подавлению экспрессии характерного для эпителия Е-кадгерина и активирует синтез N-кадгерина. Супрессия гомологов Twist в клетках карциномы специфично ингибирует процесс метастазирования опухолевых клеток из молочной железы в легкие. Таким образом, и при канцерогенезе гомологи Twist являются неотъемлемыми участниками морфогенеза (Yang et al., 2006; Tseng et al., 2015).

Характер экспрессии и предполагаемые функции гомологов Twist у Metazoa Гомологи Twist найдены у представителей всех основных групп многоклеточных, начиная с книдарий (Castanon, Baylies, 2002). Актиния Nematostella vectensis демонстрирует экспрессию Twist лишь после начала гаструляции (Martindale et al., 2004). мРНК Nv-twist распределена кольцеобразно вокруг бластопора (Рис. 5). По завершении гаструляции и у молодых полипов Nv-twist продолжает экспрессироваться в энтодермальных клетках вокруг рта и глотки.

Рис. 5. Распределение мРНК Twist у зародышей актинии Nematostella vectensis (по Martindale et al., 2004). А – гаструла; Б – планула. Звездочкой обозначен бластопор.

У гидроидного полипа Podocoryne carnea гомолог Twist экспрессируется с восьмиклеточной стадии дробления до окончания личиночного развития (Spring et al., 2000). Экспрессия Twist возобновляется, когда полип переходит к медузоидному почкованию. мРНК Twist присутствует в дедифференцирующихся и пролиферирующих клетках ранней медузоидной почки и в особом мезодерма-подобном клеточном слое

– энтокодоне – на более поздних стадиях. По мере развития почки экспрессия Twist исчезает из дифференцирующихся мышц, произошедших из энтокодона, но сохраняется в клетках немышечной природы, которые активно пролиферируют, что справедливо и для отпочковавшейся медузы. Основываясь на приведенных данных, можно сделать вывод, что ген Twist уже существовал на заре эволюции Eumetazoa и работал в активно делящихся и/или малодифференцированных клеточных популяциях.

У представителя клады Ecdysozoa, Caenorhabditis elegans, гомолог Twist экспрессируется в части мезодермальных клеток, включая предшественников эмбриональных мышц пищеварительного тракта и клетки постэмбриональной мезодермы – производные мезобласта М (будущие мышцы стенки тела, целомоциты и неисчерченные мышцы полового аппарата), причем в дифференцированных клетках экспрессия уже не наблюдается (Harfe et al., 1998). У мутантов по этому гену потомки мезобласта М могут формироваться, но не происходит их правильной дифференцировки (Corsi et al., 2000). Предполагается, что у C. elegans гомолог twist управляет дифференцировкой постэмбриональной мезодермы (Wang et al., 2006).

Среди членистоногих, кроме дрозофилы, паттерны экспрессии Twist описаны у жука Tribolium castaneum, паука Achaearanea tepidariorum и равноногого рака Parhyale hawaiensis (Рис. 6).

Рис. 6. Паттерны экспрессии гомологов Twist у зародышей артропод (по Price, Patel, 2008). Паук Achaearanea tepidariorum (spider), рак Parhyale hawaiensis (amphipod), жук Tribolium castaneum (beetle) и муха Drosophila melanogaster (fly).

Многочисленные исследования гена twist у дрозофилы показали, что на разных этапах онтогенеза он участвует в различных подпрограммах развития мезодермы (Castanon, Baylies, 2002). Во-первых, twist необходим для определения судьбы всего мезодермального зачатка (Leptin, Grunewald, 1990; Leptin, 1991; Sweeton et al., 1991;

Kusch, Reuter, 1999). twist ответственен как за приобретение мезодермальной идентичности вентральными клетками бластодермы (спецификацию), так и за осуществление морфогенеза во время гаструляции (Рис. 7). twist запускает апикальное сжатие и обеспечивает инвагинацию вентральной борозды. Клеточный цикл также находится под контролем twist: перед началом впячивания проспективной мезодермы в ней происходит арест клеточных делений, который снимается после эпителиальномезенхимной трансформации (Grohans, Wieschaus, 2000). Эта координация со стороны twist осуществляется через циклин-зависимые киназы (Nabel-Rosen et al., 2005).

Рис. 7. Иммуноцитохимическое выявление экспрессии twist у зародышей Drosophila melanogaster (по Leptin, Grunewald, 1990; Leptin, 1991). А, Б – поперечные срезы, дорсальная сторона внизу; В – вентральная проекция, передний конец слева. А – начало формирования вентральной борозды; Б, В – завершение инвагинации мезодермы.

Во-вторых, после гаструляции twist экспрессируется в виде полос с разной интенсивностью в пределах каждого мезодермального сегмента (Baylies, Bate, 1996).

Высокий уровень экспрессии twist ведет к формированию соматических мышц и блокирует развитие других мезодермальных производных (висцеральной мезодермы, сердца). Это подтверждается экспериментами, в которых эктопическая экспрессия twist в эктодермальных клетках репрограммировала их в направлении мышечной дифференцировки (Baylies, Bate, 1996). Таким образом, twist является селектором миогенной дифференцировки в эмбриогенезе, а также участвует в спецификации части клеток-основательниц соматической мускулатуры (Baylies, Bate, 1996; Furlong et al., 2001; Furlong, 2004).

Наконец, экспрессия twist поддерживает недифференцированных предшественников взрослой мускулатуры в состоянии пролиферирующих миобластов.

Это продолжается вплоть до начала метаморфоза. Экспрессия twist исчезает на стадии ранней куколки, когда начинается дифференцировка дефинитивной мускулатуры (Bate et al., 1991; Currie, Bate, 1991).

Развитие Tribolium castaneum имеет ряд существенных отличий, но, как и у дрозофилы, гомолог Twist у этого насекомого начинает экспрессироваться очень рано в презумптивной мезодерме (Sommer, Tautz, 1994; Handel et al., 2005). T. castaneum является насекомым с короткой зародышевой полоской, поскольку лишь сегменты головы образуются единовременно, а сегменты груди и брюшка формируются последовательно из зоны роста. После гаструляции экспрессия Tc-twist остается только в мезодерме трех головных сегментов и в терминальной части зоны роста. Механизм образования мезодермы из зоны роста до сих пор остается непонятым. Известно, что по мере образования новых сегментов экспрессия Tc-twist в них возобновляется, а домен экспрессии в зоне роста сокращается и исчезает вовсе, когда все сегменты сформированы. В любом случае, когда бы ни происходила спецификация мезодермы абдоминальных сегментов у Tribolium, все мезодермальные клетки рано или поздно проходят этап экспрессии Tc-twist.

Интересные данные по развитию мезодермы были получены на пауке Achaearanea tepidariorum (Yamazaki et al., 2005; Oda et al., 2007). Предполагается, что гомолог Twist у этого животного демонстрирует исключительно мезодермальную экспрессию как раз в момент интернализации мезодермы (Рис. 6). Показано, что At.twist-положительные клетки выселяются из эктодермы зародыша. Выбор между эктодермальной и мезодермальной судьбой клетки происходит с помощью DeltaNotch сигналинга. Оказавшиеся под эктодермой At.twist-положительные клетки (клетки мезобласта) группируются поперечными полосами в будущих сегментах просомы. Слабый сигнал At.twist существует и в хвостовой лопасти – зоне роста паукообразных, из которой формируются сегменты опистосомы, в мезодерме которых гомолог Twist экспрессируется на высоком уровне. Далее, экспрессирующие At.twist клетки распределяются в основном в развивающихся конечностях, где на морфологическом уровне была описана локализация соматической и висцеральной мезодермы. Все это позволяет упомянутым авторам рассматривать гомолог Twist у Achaearanea в качестве надежного маркера мезодермы.

Особым образом экспрессируется гомолог Twist у равноногого рака Parhyale hawaiensis (Price, Patel, 2008). Выбивающимся из ряда наблюдаемых у членистоногих паттернов экспрессии гомологов Twist является отсутствие транскрипта Ph-twist на ранних стадиях развития (Рис.

6). У P. hawaiensis Twist начинает экспрессироваться только во время роста зародышевой полоски, тогда как спецификация мезодермы у этого рака происходит на стадии восьми бластомеров. Экспрессия Ph-twist приурочена к отдельной клеточной линии, которая вносит основной вклад в материал мезодермы конечностей. Предполагается, что экспрессия Ph-twist в этой клеточной популяции предотвращает преждевременную мышечную дифференцировку.

Переходя к рассмотрению паттернов экспрессии гомологов гена Twist у второй клады билатеральных животных – Lophotrochozoa (которую все чаще называют термином Spiralia, хотя спиральное дробление свойственно далеко не всем ее представителям), стоит отметить, что по данной теме существует всего около десятка работ, выполненных на аннелидах, моллюсках, плоских червях, немертине и брахиоподе. Некоторые из них носят отрывочный характер и не дают полной уверенности в точности приведенных результатов. Все данные о пространственновременной экспрессии гомологов Twist у спиралий получали при помощи выявления мРНК гибридизацией in situ.

Впервые для Spiralia экспрессия гомолога Twist изучалась у брюхоногого моллюска Patella vulgata (Nederbragt et al., 2002). В этой работе были охвачены лишь ранние стадии развития (до формирования поздней трохофорной личинки). Во время дробления, по интерпретации авторов, мРНК Pv-twi не присутствует, а появление сигнала после выполнения протокола гибридизации in situ по ряду причин называют артефактом. Достоверную клеточную локализацию сигнал мРНК изучаемого гена приобретает на стадии ранней трохофоры. Экспрессия Pv-twi приурочена к внутренним тканям верхнего полушария личинки. По мере развития трохофоры домен экспрессии расширяется и кроме эписферы охватывает небольшую часть гипосферы. В соответствии с картой клеточных линий, авторы связывают экспрессию Pv-twi с частью потомков эктомезодермальных микромеров 2b, 3a и 3b. Экспрессия Pv-twi ни в мезотелобластах, ни в мезодермальных полосках не показана.

У другой гастроподы – Crepidula fornicata – мРНК Twist присутствует во всех бластомерах дробящегося зародыша (Henry et al., 2010). Во время гаструляции экспрессия Twist локализована вокруг бластопора в презумптивной эктомезодерме и эктодерме, но не в энтомезодерме (Perry et al., 2015). У поздних зародышей на стадиях органогенеза экспрессия Twist не отмечена в мезенхиме мезодермальной природы, зато сигнал присутствует во многих эктодермальных клетках (зачатках головы, ноги, передней кишки, раковинной железы и прототроха). Исходя из вышесказанного, можно заключить, что гомолог Twist у моллюсков не связан с процессом спецификации мезодермы, а участвует в паттернировании и дифференцировке эктомезодермальных и эктодермальных производных.

Наиболее полными для Spiralia являются сведения, приведенные в работе Дилл с соавт. (Dill et al., 2007). В геноме полихеты Capitella sp. I. выявлено 2 гомолога гена Twist (CapI-twt1 и CapI-twt2). Ни один из них не экспрессируется до конца гаструляции.

Этот факт свидетельствует не в пользу того, что гомологи Twist у полихет участвует в спецификации клеточных линий мезодермы. Однако на стадии поздней гаструлы мРНК обоих гомологов Twist присутствует как в мезодермальных полосках (т. е. в энтомезодерме), так и в клетках головной мезодермы (т. е. в эктомезодерме) (Рис. 8).

Позднее в личиночном развитии у CapI-twt1 появляются 2 новых домена экспрессии в предполагаемых мышечных предшественниках передней и задней кишки, тогда как CapI-twt2 помимо мезодермы начинает экспрессироваться в эктодермальных производных (головном мозге и эпителии передней кишки). После начала работы предпигидиальной зоны роста экспрессия обоих гомологов наблюдается в ее мезодермальной части и в мезодерме последних сегментов.

Рис. 8. Экспрессия CapI-twt1 у седентарной полихеты Capitella sp. I. (по Dill et al., 2007).

Вентральная проекция, передний конец слева. А – поздняя гаструла; Б – трохофора, В– Д – метатрохофора. Экспрессия в головной мезодерме (эктомезодерме) отмечена косой стрелкой, в мезодермальных полосках (энтомезодерме) – горизонтальными стрелками, вокруг задней кишки – вертикальным наконечником стрелки. Звездочкой обозначен стомодеум, t – телотрох, m – мезодермальный слой, е – эктодермальный эпителий.

Полученные результаты интерпретируются упомянутыми авторами как доказательство того, что гомологи Twist у Capitella sp. I. не могут участвовать в спецификации мезодермы, а играют роль в ее дальнейшем паттернировании и дифференцировке. Наиболее вероятными частями мезодермы, развитием которых управляют CapI-twt1 и CapI-twt2 называются целомическая мезодерма и/или поздно формирующиеся личиночные мышцы. Хотя приводимые данные касаются только ларвального развития, стоит отметить, что наличие экспрессии обоих гомологов Twist в зоне роста свидетельствует об их участии в развитии всей постларвальной мезодермы.

Более того, если рассматривать зону роста полихет как заново формирующуюся в результате метаморфоза, то можно придать гомологам Twist функцию именно спецификаторов постларвальной мезодермы. К сожалению, данный вопрос никак не обсуждается авторами публикации.

У нереиды Platynereis dumerilii мРНК Twist наследуется всеми клеточными линиями в ходе дробления, но у постгаструляционных зародышей и личинок распределяется исключительно в мезодермальных производных (Steinmetz, 2006;

Pfeifer et al., 2013; Pfeifer et al., 2014). Авторы связывают домены экспрессии Pdu-twist с зачатками различных мышц экто- и энтомезодермального происхождения.

Исследование пиявки Helobdella robusta показало наличие материнских мРНК и белкового продукта гена Twist уже в ооците (Soto et al., 1997; Farooq et al., 2012). В ходе развития эти продукты локализуются в телоплазме и в основном наследуются линией бластомера D, но далее тканеспецифичности их распределения в мезодермальных бластомерах не наблюдается.

У плоских червей экспрессия Twist существенно отличается от ситуации остальных спиралий, что, несомненно, связано с произошедшими в их эволюции глубокими модификациями эмбриогенеза. На эмбриональных и ювенильных стадиях ацели Isodiametra pulchra мРНК ни одного из двух клонированных из этого червя генов Twist не выявляется (Chiodin et al., 2013). У взрослых особей экспрессия обоих гомологов Twist наблюдается в небольшом количестве всех известных мезодермальных производных – миоцитах, гонадах и необластах. В развитии пресноводной планарии Schmidtea polychroa (Tricladida) Twist активен в мышечной стенке провизорной структуры – эмбриональной глотке (Martn-Durn et al., 2010). На более продвинутых стадиях экспрессия Spol-twist связана с мышцами дефинитивной глотки и разбросанными вокруг нее отдельными клетками зародышевой полоски (предположительно миоцитами).

В ходе вторично эмбрионизованного развития немертины Lineus ruber (Pilidiophora) Twist транскрибируется много позже завершения эмбриональных морфогенезов (Martn-Durn et al., 2015). У инкапсулированной шмидтовской личинки, питающейся за счет адельфофагии, экспрессия Twist отмечена во всех имагинальных дисках. Во время метаморфоза и у невылупившихся ювенилей Twist экспрессируется в большинстве тканей тела. Такие данные свидетельствуют по мнению авторов, о том что мезодерма у L. ruber может формироваться не в эмбриогенезе, а лишь в процессе метаморфоза.

Рис. 9. Экспрессия мРНК Twist в ходе эмбрионального и личиночного развития брахиоподы Terebratalia transversa (по Passamaneck et al., 2015). А–D – латеральная проекция; E–H – вид с вегетативного полюса. А, B, E, F – гаструла; C, G – ранняя личинка;

D, H – трехлопастная личинка. Стрелками обозначены домены экспрессии в основании хетоносных мешков, звездочка – бластопор.

Наиболее ранний выявленный паттерн экспрессии Twist у брахиоподы Terebratalia transversa приурочен к стенке архентерона, примыкающей к бластопору (Passamaneck et al., 2015). Эта локализация мРНК Twist связана с мезодермальными клетками, которые в дальнейшем развитии билатерально выстраиваются внутри апикальной лопасти и по бокам мантийной складки (Рис. 9). Передней домен экспрессии соответствует головной мезодерме (возможно гомологичной эктомезодерме), а туловищный домен прилегает к хетоносным мешкам, где развиваются специализированные мышцы. Учитывая разнообразие описанных картин распределения продуктов Twist и особенностей модусов развития в упомянутых таксонах Spiralia, весьма сложно найти какие-либо общие закономерности. Наиболее консервативной чертой следует признать участие Twist в миогенезе, а связь с более ранними этапами спецификации мезодермы (в ходе гаструляции) можно предположить лишь для полихет и брахиопод.

Deuterostomia является третьей кладой Bilateria, у представителей которой мы рассмотрим роль гомологов гена Twist в развитии. Наиболее древней группой вторичноротых являются иглокожие.

У морских ежей мезодерма состоит из трех компонентов: первичной мезенхимы, вторичной мезенхимы (PMC и SMC соответственно) и целома.

Предшественники первичной мезенхимы – микромеры – обособляются на 16-ти клеточной стадии дробления. Их потомки выселяются из стенки бластулы, претерпевают ингрессию (классический пример эпителиально-мезенхимного перехода) и дают начало личиночному скелету. Первичная кишка (архентерон), вторичная мезенхима и целом происходят из венца мезомеров veg2. Результатом дифференцировки SMC являются пигментные клетки, личиночные мышцы и клеточные элементы бластоцеля (Иванова-Казас, 1978).

Экспрессия гомолога Twist у морского ежа Lytechinus variegatus выявляется с помощью гибридизации in situ в вегетативной пластинке незадолго до начала выселения из нее клеток первичной мезенхимы (Wu et al., 2007; Wu et al., 2008). После ингрессии PMC экспрессия Lvtwist в них сохраняется. Кроме того, после начала инвагинации вегетативной пластинки мРНК Lvtwist появляется в клетках вторичной мезенхимы и присутствует в них до конца гаструляции.

В результате экспериментов с применением морфолино к гену Lvtwist (функциональный нокаут) у L. variegatus наблюдались множественные нарушения в развитии первичной и вторичной мезенхимы (Wu et al., 2008). Ингрессия PMC происходила с сильным опозданием, не формировался правильный паттерн личиночного скелета. Среди дефектов развития SMC было отмечено почти полное отсутствие пигментных клеток и личиночных мышц. Кроме того, не происходило нормальной элонгации архентерона, важную роль в которой играют клетки бластоцеля.

Эти и ряд других опытов, а также детальный анализ регуляторных генных сетей позволили Ву с соавт. (Wu et al., 2008) сделать вывод о том, что гомолог Twist играет важную роль в разных аспектах развития мезодермы у морских ежей. Одной из его функций является поддержание специфицированного состояния клеток первичной мезенхимы, что позволяет им правильно пройти ингрессию. На более поздних стадиях Lvtwist контролирует дифференцировку как первичной, так и вторичной мезенхимы.

Наблюдение за динамикой экспрессии гомолога Twist у ланцетника Branchiostoma belcheri tsintauense было произведено с помощью молекулярной гибридизации in situ, начиная со стадии поздней гаструлы (Yasui et al., 1998). У эмбрионов на этой стадии мРНК Bbtwist была обнаружена в первой паре презумптивных сомитов и в дорсальной стенке архентерона (презумптивной хорде).

Затем экспрессия Bbtwist усиливалась в латеральных стенках сомитов и в хорде. На стадии поздней нейрулы транскрипт Bbtwist также присутствовал в передней стенке архентерона и в эвагинирующих из него латеральных дивертикулах, которые рассматриваются рядом авторов как передние сомиты. Сигнал Bbtwist не был обнаружен в отделившемся от архентерона левом латеральном дивертикуле, тогда как в правом дивертикуле ген экспрессировался во время формирования у личинки головного целома. На этой же стадии сигнал мРНК Bbtwist присутствовал в передней части хорды. У более развитых личинок очень слабая экспрессия Bbtwist была зафиксирована в постериорной части дифференцирующейся хорды и параксиальной мезодермы.

Из описанных паттернов экспрессии, согласно упомянутым авторам, следует, что Twist у бесчерепных вовлечен в раннюю дифференцировку мезодермальных производных. Предполагается, что продолжительная экспрессия Bbtwist в передней части хорды отражает особенности пролиферации слагающих ее клеток, что позволило данному органу занять столь вынесенное вперед положение в теле бесчерепных.

Экспрессию Bbtwist в передней стенке архентерона авторы связывают с анцестральной способностью вторичноротых продуцировать мезодерму из крыши первичной кишки.

Среди позвоночных животных роль Twist в развитии была исследована у четырех модельных объектов: костистой рыбы Danio rerio (Germanguz et al., 2007), лягушки Xenopus laevis (Hopwood et al., 1989; Stoetzel et al., 1998; Linker et al., 2000), курицы Gallus gallus (Scaal et al., 2001; Tavares et al., 2001) и мыши Mus musculus (Wolf et al., 1991; Stoetzel et al., 1995; Gitelman, 1997; Ota et al., 2004). В геноме каждого из этих животных найдено от одного до четырех гомологов гена Twist.

Несмотря на существующие различия в паттернах экспрессии этих генов, для всех позвоночных справедливы следующие положения:

Twist достоверно начинает экспрессироваться во время гаструляции в мезодермальных клетках;

на стадии органогенеза мРНК Twist выявляется в сегментационной пластинке, эпителиальных сомитах и латеральной мезодерме;

Twist контролирует миграцию и дифференцировку клеток черепного отдела нервного гребня;

на стадии хвостовой почки Twist экспрессируется в мезенхиме конечностей, жаберных дугах, а также в склеротоме и дермотоме дифференцированных сомитов.

Кроме того, у представителей Anamnia (рыб и амфибий), как и у ланцетника, некоторые гомологи Twist экспрессируются в организаторе, а затем и в хорде, что считается анцестральным состоянием для Chordata (Yasui et al., 1998; Germanguz et al., 2007). У птиц Twist участвуют в развитии дермы, перьев и кожных чешуй (Scaal et al., 2001; Tavares et al., 2001; Hornik et al., 2005). Гомологи Twist млекопитающих кроме всего прочего экспрессируются в мезенхиме нёба, зачатках зубов и швах костей черепа (Rice et al., 2000).

Основную функцию, которую приписывают семейству Twist позвоночных, является контроль над дифференцировкой мезодермальных производных (Castanon, Baylies, 2002; O’Rourke, Tam, 2002). В частности предполагается, что экспрессия гомологов Twist в склеротоме и дермотоме предохраняет их клетки от мышечной дифференцировки. В подтверждение этой гипотезы можно привести эксперименты, в которых клеточную культуру миобластов разной степени дифференцировки трансфецировали соответствующим гомологом гена Twist (Hjiantoniou et al., 2008). В результате таких манипуляций происходила не только остановка миогенеза, но даже дедифференцировка синцитиальных мышечных трубочек в одноядерные миобласты.

Причастность Twist к развитию нервного гребня является иллюстрацией консервативной функции этого гена в эпителиально-мезенхимном переходе.

Насколько значимую роль гомологи Twist играют в процессах индукции и спецификации при гаструляции у позвоночных пока неясно, поскольку функциональный анализ производился только на мышах. На основе паттернов экспрессии можно лишь предполагать, что роль эта уменьшалась в эволюции от низших позвоночных (Anamnia) к высшим (Amniota).

Структура и механизм функционирования на молекулярном уровне Ген Twist кодирует транскрипционный фактор, относящийся к суперсемейству basic Helix-Loop-Helix (bHLH) содержащих белков (Leptin, 1991). basic домен богат основными аминокислотами и специфично связывается с участком ДНК, названным Ебоксом, консенсусная последовательность которого является гексануклеотидом 5’CANNTG-3’. Мотив Helix-Loop-Helix состоит из двух -спиралей, соединенных гибкой петлей. Этот мотив придает способность bHLH транскрипционным факторам димеризоваться.

Twist (белковый продукт Twist) может образовывать как гомодимеры, так и гетеродимеры, что обеспечивает разную афинность к регуляторным элементам многочисленных генов-мишеней (Castanon et al., 2001; Wong et al., 2008). В комплексе с разными партнерами Twist может выполнять функцию репрессора или активатора транскрипции генов, содержащих Е-бокс. Важным фактором в выборе партнера для димеризации является наличие у Twist посттрансляционных модификаций, таких как фосфорилирование (Cai, Jabs, 2005; Firulli, Conway, 2008).

Благодаря способности димеризоваться, регуляция транскрипции может осуществляться не напрямую, а опосредованно, так как, конкурируя за связывание с определенными партнерами, Twist выбирает для них гены-мишени (в отсутствие Twist, его потенциальные партнеры образуют другие димеры и взаимодействуют с другими мишенями, транскрипцию которых напрямую Twist не регулирует). Кроме того, Twist может связываться с белками не только HLH мотивом. Взаимодействие basic доменов Twist и MyoD (bHLH миогенный регуляторный фактор) приводит к неспособности последнего активировать свои мишени и, как следствие, блокирует дифференцировку мышц у позвоночных (Hamamori et al., 1997).

Давно известными мишенями Twist у дрозофилы являются гены heartless (рецептор FGF), Mef2 (консервативный фактор мышечной дифференцировки), snail (транскрипционный фактор, необходимый для эпителиально-мезенхимного перехода) и tinman (консервативный гомеодоменный транскрипционный фактор, принимающий участие в развитии сердца). Гомологичные мишени для Twist описаны у Caenorhabditis elegans и у позвоночных (Castanon, Baylies, 2002; Ciglar, Furlong, 2009).

Относительно недавно было показано значение Twist в механизме РНКинтерференции у дрозофилы (Sokol, Ambros, 2005). Так, Twist является необходимым и достаточным фактором для активации транскрипции microRNA-1 – еще одного участника мышечной дифференцировки.

Исследования с использованием метода ChIP-on-chip (иммунопреципитация хроматина с последующим микроэррей анализом) выявили у дрозофилы более 2000 связывающихся с Twist цис-регуляторных модулей и почти 500 прямых генов-мишеней (Sandmann et al. , 2007; Zeitlinger et al., 2007). Неожиданным оказалось то, что Twist регулирует почти все кассеты генов, необходимые для пролиферации, и гены, участвующие в морфогенезе и клеточной миграции. Таким образом, теоретически Twist способен контролировать почти 25% всех аннотированных транскрипционных факторов дрозофилы, которые могут представлять полный набор необходимых регуляторов раннего развития этой системы. Пространственно-временная специфичность взаимодействия Twist с энхансерами определяется, как полагают Вонг с соавт. (Wong et al., 2014), уровнем активности (концентрацией) Twist и контекстом (структурой энхансера, набором доступных кофакторов).

Завершая раздел, посвященный транскрипционному фактору Twist, необходимо обратить внимание на следующие его особенности:

возникнув на заре эволюции Eumetazoa, Twist изначально был связан с клетками мезодермальной природы, находящимися в малодифференцированном состоянии;

у Bilateria Twist экспрессируется почти исключительно в мезодерме, причем у некоторых организмов, начиная со стадий ее спецификации;

молекулярные механизмы действия транскрипционного фактора Twist обуславливают разнообразие его функций на разных этапах развития;

Twist является одним из главных участников генетических программ развития мезодермы у всех Eumetazoa.

1.1.5. Гомеодоменный транскрипционный фактор Mox Структура и гомологи Mox относится к классу гомеобокс-содержащих генов Antennapedia и кодирует соответствующий гомеодоменный ТФ. Впервые Mox (от англ. mesoderm/mesenchyme homeobox gene) был выделен у мыши и назван так в связи со своей мезодермальной тканеспецифичностью (Candia et al., 1992). В геноме мыши, как и других позвоночных, выявлено два паралога – Mox1 и Mox2. Ортолог Mox2 у крысы был открыт независимо и назван Gax (от англ. growth arrest-specific homeobox gene) (Gorski et al., 1993). В последнее время Mox гены позвоночных чаще называют аббревиатурой Meox.

Расположение последовательности Mox на хромосоме тесно связано у большинства животных с кластером Hox генов. Предполагается, что далекий предок гена Mox возник в ранней эволюции многоклеточных вследствие тандемной дупликации одного из анцестральных (возможно, самого первого) гомеобокссодержащего гена Antennapedia класса (Minguilln, Garcia-Fernndez, 2003). Позднее весь protoHox кластер и ассоциированные с ним гомологи подвергся дупликации, что дало начало наборам paraHox, Hox и Hox-связанным генам (Mox, Evx и др.) (Minguilln, Garcia-Fernndez, 2003; Ferrier, 2012). Таким образом, Mox не выводят от определенного Hox или paraHox гена, отмечая их более или менее одновременное происхождение. Однако Mox принято включать в состав т.н. расширенного Hox кластера (extended Hox cluster), хотя встречаются и отклонения, как например у дрозофилы, гомолог Mox которой (названный buttonless) сцеплен не с Hox, а с NK кластером.

У другого представителя клады Ecdysozoa – нематоды C. elegans – гомолог Mox вовсе отсутствует. У большинства беспозвоночных, в геноме встречается единственный гомолог Mox, что является анцестральным состоянием для первично- и вторичноротых (Minguilln, Garcia-Fernndez, 2002).

У позвоночных существует два паралогичных гена:

Mox1 сцеплен с HoxB кластером, а Mox2 закодирован вблизи кластера HoxA.

Контрастным случаем является наличие четырех паралогов Mox у книдарий.

Гены MoxA, MoxB, MoxC и MoxD у актинии Nematostella vectensis считают результатом независимых тандемных дупликаций, поскольку все они в хромосоме идут друг за другом и сонаправлены (Ryan et al., 2007).

Тканеспецифичность и роль в развитии Экспрессия гомологов Mox в развитии Nematostella vectensis начинается после завершения периода гаструляции, причем паттерны экспрессии четырех генов неотличимы друг от друга (Ryan et al., 2007). У планул сигнал локализуется в энтодерме на анимальном полюсе в виде кольца. По мере превращения личинки в полип транскрипты Mox выявляются в узком участке глоточной энтодермы, примыкающей ко рту.

Единственными представителями Spiralia, у которых была изучена экспрессия Mox, являются брюхоногие моллюски рода Haliotis. По данным RT-PCR транскрипция Mox начинается у Haliotis rufescens на стадии личинки трохофоры и продолжается длительное время после метаморфоза (Degnan et al., 1997). Пространственное распределение мРНК Mox у трохофоры Haliotis asinina приурочено ко внутренним мезодермальным клеткам, организованным в виде двух билатерально-симметричных полос (Hinman, Degnan, 2002). К сожалению, из-за слабой изученности эмбриологии Haliotis увязать паттерн экспрессии с конкретной клеточной линией (с экто- или энтомезодермой) авторам не удалось. У более зрелых личинок (велигеров) Mox экспрессируется в клетках, формирующих мускулатуру ноги, причем многочисленные мышечные волокна уже выявляются в ноге на этой стадии (Hinman, Degnan, 2002).

Изучение гомолога Mox дрозофилы, известного как buttonless, показало исключительно зиготическую его экспрессию, начинающуюся со стадий сегментированной зародышевой полоски. Транскрипты buttonless были обнаружены в отдельной линии клеток под названием DM (dorsal median), пара которых лежит вдоль дорсомедиальной границы ЦНС в каждом грудном и брюшном сегменте (Chiang et al., 1994). DM клетки своими латеральными отростками соединяют левую и правую части мезодермы и сами также принадлежат к этому зародышевому листку. При мутации buttonless DM клетки специфицируются (что проявляется в запуске экспрессия самого buttonless), но их дальнейшая дифференцировка (и поддержание экспрессии buttonless) не происходит, и этот клеточный тип не формируется. Фенотипически мутация также проявляется в нарушении направленного роста аксонов медианного и поперечных нервов, что указывает на роль DM клеток в этом процессе. Как выяснилось позднее, за активацию buttonless у дрозофилы ответственен гомеобокс-содержащий ген NK-кластера tinman (Yin, Frasch, 1998).

Mox у Saccoglossus kowalevskii (Hemichordata) начинает экспрессироваться после окончания гаструляции, когда целомические мешки уже отпочковались от архентерона. В этот период сигнал Mox отмечен исключительно в парном целоме метасомы (Lowe et al., 2006). На более продвинутых стадиях экспрессия в дорсальной части метацелей ослабевает, так что к третьему дню развития она наблюдается в пределах узкой вентромедиальной полоски мезодермальных клеток мета- и мезосомы. Следует отметить, что вентральная сторона у S. kowalevskii соответствует таковой у первичноротых (Lowe et al., 2006).

У другого вторичноротого беспозвоночного – ланцетника – в отличие от остальных хордовых был найден только один гомолог Mox. Этот ген экспрессируется у Branchiostoma floridae на переднем конце пресомитной мезодермы и в новообразованных сомитах (Minguilln, Garcia-Fernndez, 2002). Почти сразу после формирования каждого из сомитов экспрессия в нем начинает затухать вплоть до ее полного исчезновения при отделении последующего метамера. Кроме того, начиная со стадии пяти сомитов, в их расположении и паттерне экспрессии Mox прослеживается явная лево-правая асимметрия, при которой метамеры левой стороны формируются немного раньше и лежат ростральнее относительно правых. На более поздних стадиях эмбриогенеза Mox экспрессируется во внутренних клетках хвостовой почки.

У позвоночных животных от рыб до млекопитающих гомологи Mox проявляют устойчивую тканеспецифичность, приуроченную к сомитам и их производным (Candia et al., 1992; Candia, Wright, 1995; Candia, Wright, 1996; Neyt et al., 2000; Rallis et al., 2001).

У амниот Mox1 начинает экспрессироваться при гаструляции в ранних мезодермальных клетках, а затем мРНК локализуется в пресомитной мезодерме и сомитах, у мыши – повсеместно с наиболее интенсивным сигналом в каудальных доменах склеротомов (Candia et al., 1992; Candia, Wright, 1996), а у курицы – только в дермомиотомах (Reijntjes et al., 2007). Транскрипты Mox2 появляются заметно позже – в эпителиальных сомитах, а во время дифференциации сомита сильнее всего соответствующие гомологи и у мыши, и у курицы экспрессируются в клетках склеротома (Candia, Wright, 1996; Rallis et al., 2001). Оба паралога Mox также имеют пересекающиеся, но неидентичные домены экспрессии в почке конечности высших позвоночных (Candia, Wright, 1996;

Reijntjes et al., 2007). Кроме того, у млекопитающих активность Mox2 обнаружена в кардиомиоцитах, сердечной трубке, гладкомышечных клетках и эндотелии кровеносных сосудов (Gorski et al., 1993; Skopicki et al., 1997; Patel et al., 2005).

Мутационный анализ подтвердил, что ТФ Mox1 и Mox2 являются неотъемлемыми компонентами генетической сети сомитогенеза. У мышей с нулевой мутацией Mox2 не развиваются отдельные виды мышц, снижена общая мышечная масса, но не страдает развитие скелета (Mankoo et al., 1999). Напротив, при мутации по Mox1 миогенез остается малоизмененным, но нарушается формирование осевого скелета, особенно ростральной его части: наблюдаются дефекты строения затылочных костей, краниовертебрального сочленения, позвонков и ребер (Skuntz et al., 2009). Как выяснили совсем недавно, у людей именно мутации по Mox1 в гомозиготном состоянии ведут к множественным аномалиям развития шейного отдела позвоночника, известным как синдром Клиппеля–Фейля аутосомно-рецессивного подтипа (Bayrakli et al., 2013; Mohamed et al., 2013). В сравнении с эффектом двойной мутации Mox1/Mox2 эти данные говорят о том, что у млекопитающих функция Mox2 в склеротоме, но не миотоме, может быть компенсирована за счет Mox1, и наоборот, Mox1 заменим в развитии миотомов, но не склеротомов.

Дальнейшие исследования показали, что двойная нулевая мутация Mox1/Mox2 приводит к катастрофическим последствиям в развитии сомитов: нарушается их эпителизация и правильное рострокаудальное распределение, не поддерживаются границы соседних сомитов (Mankoo et al., 2003). Страдает дифференциация клеток как склеротома, так и дермомиотома. Осевой скелет и большинство скелетных мышц не формируется: у новорожденных мышат дорсомедиально расположены два монолитных хряща, соответствующие нейральным дугам позвонков по положению;

тела позвонков, ребра и тазовый пояс отсутствуют, равно как и мышцы шеи, спины, живота, конечностей и бурый жир. Нарушение сомитогенеза проявляется в образовании мезодермальных метамеров неправильной формы, вокруг которых не наблюдается базальной мембраны. На более поздних стадиях не происходит морфологической дифференциации сомита на склеротом и дермомиотом; на месте правильного периодического паттерна из клеток склеротома передней и задней доли соседних сомитов (которые в норме дают зачаток одного позвонка) находится однородная нерасчлененная мезенхима.

У мутантов Mox1/Mox2 в пресомитной мезодерме (сегментационной пластинке) не нарушается локализация компонентов Delta/Notch сигналинга, ответственных за работу “сегментационных часов”, что соответствует морфологически выявляемой метамеризации параксиальной мезодермы. Однако в сформированных сомитах у таких мышиных эмбрионов нарушается нормальный паттерн экспрессии Paraxis, Dll1 и Epha4, что свидетельствует о разрушении переднезадней полярности сомитов. Почти полное подавление экспрессии Pax1, Twist в отсутствие обоих Mox и в меньшей степени влияние на экспрессию Pax9, Foxc2 говорит о запуске молекулярной спецификации склеротомов, но глубочайшей неисправности программы их дифференцировки. Также коренным образом нарушается генетическая регуляторная сеть развития дермомиотомов: вследствие мутации исчезает экспрессия миогенных факторов Pax1, Pax3, сильно подавляется экспрессия Myf5, Myogenin (Mankoo et al., 2003).

В целом, данные мутационного анализа дают основания считать ТФ Mox позвоночных важнейшими регуляторами развития мезодермы, ее морфогенеза, паттернирования и дифференцировки. Mox1 и Mox2 действуют с частичным перекрыванием функций друг друга и занимают достаточно высокое положение в иерархии как миогенеза, так и хондрогенеза/оссификации. Возможно, они функционируют в параксиальной мезодерме для обеспечения компетенции при ответе клетками сомита на индуктивные воздействия извне (на дорсально действующие сигналы Wnt и вентромедиальный источник Shh) (Mankoo et al., 2003).

Регуляция на выше- и нижележащих уровнях У Xenopus факторы Mef2d и Paraxis (один из паралогов Twist) активируют в дермомиотоме экспрессию Mox2, который в свою очередь напрямую позитивно регулирует транскрипцию Pax3 (Della Gaspera et al., 2012). В исследовании миогенеза in vitro на мышиной культуре клеток для Pax3 и Mox1 также показано наличие взаимной положительной обратной связи (Petropoulos et al., 2004). При этом они вместе с фактором Gli2 запускают экспрессию генов MRF, коммитируя клетки к мышечной дифференцировке. Для Mox позвоночных идентифицированы партнеры, включая факторы Pax, для белок-белковых взаимодействий, опосредованных через гомеодомен (Stamataki et al., 2001; Lin et al., 2005).

Mox1 и Mox2 напрямую активируют экспрессию ингибиторов циклин-зависимых киназ, приводя к аресту клеточного цикла в эндотелии кровеносных сосудов (Douville et al., 2011). Хорошо описаны антагонистические отношения между Mox2 (Gax) и пролиферацией в экспериментальных условиях (Fisher et al., 1997; Gorski, Leal, 2003) и при патологических процессах, таких как атеросклероз, рак, гипертензия (Csoka et al., 2004; Patel et al., 2005; Xia et al., 2011). В связи с этой способностью Mox2 подавлять митотическую активность клеток кровеносной системы и ангиогенез, он являются привлекательной потенциальной мишенью для терапевтических воздействий (Gorski, Leal, 2003).

1.2. Развитие мезодермы у Spiralia

1.2.1. Клеточные линии и морфогенез мезодермы По большей части, представители группы Spiralia, к которым в эмбриологическом понимании относятся аннелиды, моллюски, немертины и плоские черви, характеризуются стереотипным паттерном дробления с ранней сегрегацией зародышевых листков и клеточных линий. Традиционно в развитии спиралий выделяют два мезодермальных компонента: эктомезодерму и энтомезодерму.

Предполагается, что эктомезодерма, или личиночная мезенхима, которая погружается во время гаструляции внутрь зародыша в виде отдельных клеток, онтогенетически происходит из эктодермы, а энтомезодерма, соответственно, – из энтодермы (Hyman, 1951). Эмбриональным источником эктомезодермы у разных видов спиралий являются клетки второго и/или третьего квартета микромеров (Иванова-Казас, 1977; Anderson, 1973). Долгое время было принято считать, что эктомезодерма дифференцируется в личиночные мышцы, не сохраняющиеся во взрослом состоянии, в то время как энтомезодерма – главный ресурс дефинитивных мезодермальных структур. Однако, в свете новых данных по прослеживанию судьбы клеточных линий это положение было пересмотрено (Козин, Костюченко, 2016;

Schmidt-Rhaesa, 2007). Единственный эктомезодермальный источник у турбеллярии Hoploplana inquilina – клетка 2b – наравне с энтомезодермальным бластомером 4d дает мышцы мюллеровской личинки, которые сохраняются и после метаморфоза (Boyer et al., 1996). В основном потомки микромеров третьего квартета и, возможно, 2b у моллюска Patella vulgata дифференцируются в эктомезодерму и эктодерму гипосферы личинки (Dictus, Damen, 1997). У полихеты P. dumerilii эктомезодерму слагают микромеры третьего квартета, производными которых являются мышечная обкладка глотки (из потомков 3c и 3d) и мышцы головы (из потомков 3a и 3b) (Ackermann et al., 2005). У пиявок эктомезодерма (клетки 3a, 3c, 3d и, возможно, 1a–1d) формирует мышцы хоботка, соединительнотканные элементы и сеть из волокон в стенке тела с неустановленной функцией (Huang et al., 2002).

Рис. 10. Генеалогия соматобласта 4d у брюхоногого моллюска Crepidula fornicata (по Lyons et al., 2012). Предполагаемая или установленная судьба указанных бластомеров подписана справа, цвет шрифта обозначает принадлежность производных к энтодерме (желтый), мезодерме (красный), ППК (фиолетовый), плюрипотентным телобластам (зеленый). В нижнем левом углу приведена схема расположения потомков 4d, когда полоска состоит из 16 клеток.

Говоря о клеточной линии энтомезодермы, следует, напротив, отметить ее чрезвычайно высокую консервативность – за редким исключением энтомезодерма спиралий развивается из бластомера 4d, называемого вторым соматобластом. У большинства спиралий 4d является мезэнтобластом, т.е. заключает в себе и мезодермальные, и энтодермальные потенции, а зачастую доказано происхождение первичных половых клеток (ППК) из 4d. Порядок разделение указанных клеточных судеб сильно варьирует в разных группах. У поликладных турбеллярий два билатерально-симметрично расположенных мезобласта (4d212 и 4d222) формируются только после третьего деления 4d, остальные потомки которого дают кишечный эпителий (Иванова-Казас, 1975). У моллюсков и аннелид 4d практически всегда делится билатерально на 2 клетки M (4d1 и 4d2), иногда обозначаемых, в основном для клителлят, мезотелобластами. Детальное исследование клеточной линии 4d у моллюсков Crepidula (Рис. 10) показало попеременное отделение от мультипотентных телобластов ML и MR то энтодермальных (1m, 3m, 4m, 5m), то мезодермальных (2m, 6m, 7m) потомков (Lyons et al., 2012). При этом в ходе асимметричных делений от остающихся более крупными М-клеток в разные стороны отпочковываются более мелкие дочерние клетки: потомки первой и третьей генерации (1m и 3m) отделяются к вегетативному полюсу, а остальные отслеженные клетки (2m, 4m, 5m, 6m) – к анимальному. Сходным образом (с центральным положением телобласта) организованы мезэнтодермальные полоски зародыша гастроподы Ilyanassa obsoleta (Rabinowitz et al., 2008).

Характер делений М-клеток у полихеты P. dumerilii гораздо больше напоминает таковой у моллюсков, нежели ситуацию олигохет и пиявок. По данным Фишер и Арендта (Fischer, Arendt, 2013) “мезотелобластоподобные” М-клетки веерообразно отделяют 7 более мелких потомков, после чего делятся равномерно и становятся далее неразличимыми, причем последовательного распределения потомков М-клеток по переднезадней оси мезодермальной полоски трохофоры не происходит. Напротив, самые ранние дочерние клетки мезотелобластов (т.н. “вторичный мезобласт”), сохраняют свое заднее положение в основании мезодермальных полосок, давая начало ППК (Rebscher et al., 2012). Традиционно М-клетки полихет также называют мезобластами (Wilson, 1892), поскольку участие 4d в построении кишки остается противоречивым. Заметим, однако, что после инъекции специализированного красителя в бластомер 4d у личинок P. dumerilii помимо меченых мезодермальных производных туловища нектохеты в районе заднего конца развивающейся кишки выявляется плотный клеточный конгломерат неустановленной тканевой принадлежности (Ackermann et al., 2005). Учитывая сообщение об участии “вторичного мезобласта” в формировании энтодермального эпителия у Nereis (Wilson, 1898), можно предположить, что и у полихет 4d выполняет роль мезэнтобласта (Козин, Костюченко, 2016).

Пожалуй, единственным однозначно доказанным среди полихет примером развития мезодермальных полосок не из бластомера 4d является случай Capitella teleta (Meyer et al., 2010). Вместо 4d эту роль здесь выполняют клетки 3c и 3d. 4d, тем не менее, также дает некоторые мышцы тела и ППК. Таким образом, у Capitella наблюдается переключение эмбрионального источника сегментной мезодермы с энтомезодермы на эктомезодерму. Филогенетически Capitella очень близка ветви поясковых аннелид, демонстрирующих вместе с ней быструю дивергенции от остальных аннелид. Высокой скорость эволюции и объясняются вторичные модификации развития этих червей.

Раннее развитие поясковых аннелид (олигохет и пиявок), как и полихет, является спиральным, однако во многом сильно измененным: правильность спирального дробления быстро утрачивается, и зародыш рано становится билатерально-симметричным. Кроме того, развитие Clitellata прямое и не содержит личиночных стадий и метаморфоза (Иванова-Казас, 1975). До последнего времени было общепринято считать, что у клителлят 4d напрямую не участвует в развитии энтодермы. Известно, что лишь небольшое количество самых последних “излишних” потомков М-клеток и они сами на поздних стадиях сегментации сливаются с т.н.

желточным синцитием (материал объединенных макромеров), целлюляризация которого формирует стенку кишки (Liu et al., 1998; Weisblat, Huang, 2001). Совсем недавно оказалось, что и самые ранние потомки М-клеток (не участвующие в развитии сегментной мезодермы em1 и em2) у пиявки Helobdella среди прочего дают материал кишечного эпителия (Gline et al., 2011). В этой связи авторами высказывается мнение, что мезэнтодермальная сущность бластомера 4d является анцестральной (эволюционно первичной) чертой всех Spiralia.

Как и у полихет, сегментная мезодерма поясковых аннелид происходит от клетки 4d. Результатом симметричного деления 4d являются два мезодермальных телобласта, при пролиферации которых появляются билатерально-симметричные мезодермальные полоски (Иванова-Казас, 1977; Anderson, 1973). У олигохет и пиявок резко асимметрично делящиеся мезотелобласты дают начало последовательному ряду мелких первичных бластных клеток. При этом отделение всех первичных бластных клеток происходит на одном и том же полюсе мезотелобласта, так что ранние его потомки оказываются на переднем конце полоски, а поздние – на заднем.

Сами телобласты (и мезодермальные, и эктодермальные) сохраняют терминальное положение, что характерно исключительно для клителлят, а за пределами Spiralia – лишь для высших раков (Malacostraca). Заметим, что сравнение телобластического роста у этих двух дальнеродственных групп первичноротых животных не оставляет сомнения в независимости эволюционного приобретения этого признака (Scholtz, 2002;

Hunnekuhl, Wolff, 2012).

Каждая первичная бластная клетка у клителлят претерпевает ряд стереотипных делений, в результате чего образуется отдельный мезодермальный компартмент (Shimizu, Nakamoto, 2001). Клон одной первичной бластной клетки у пиявок является материалом мезодермы отдельного сегмента тела (если определять его границы диссепиментами). Поскольку ганглии нервной системы у пиявок находятся в противофазе с мезодермальными компартментами, можно также сказать, что клон одной бластной клетки в мезодермальной полоске формирует два полусомита соседних сегментов (если определять их границы по нейральным зачаткам). В любом случае следует признать, что метамеризация мезодермы у Clitellata происходит на самых ранних этапах ее развития. По предположению некоторых исследователей (Shimizu, Nakamoto, 2001), уже в момент отделения от мезотелобласта первичная бластная клетка обладает полярностью и сегментной идентичностью, что говорит о высокой степени автономности развития мезодермального зачатка клителлят.

Автономность развития мезодермы подтверждается в экспериментах по удалению соседствующих тканей. В частности у олигохет в отсутствие 2d (клеткиродоначальницы всей эктодермы сегментов) клеточные процессы, ведущие к сегментации мезодермы, происходят сходным образом с таковыми у интактных зародышей (Goto et al., 1999b). Однако у пиявок в таких экспериментах сегментация мезодермы не происходит (Blair, 1982). Этот факт связывают с тем, что в развитии пиявок существует тенденция к утрате метамерного строения, примером которой служит разрушение септ между сегментами (Shimizu, Nakamoto, 2001).

Другим интересным фактом развития мезодермы у клителлят является зависимость сегментации эктодермы от сегментации подлежащего мезодермального зачатка. И у олигохет, и у пиявок при удалении мезодермальных телобластов не происходит метамеризации эктодермальных покровов (Blair, 1982; Torrence, 1991;

Nakamoto et al., 2000).

Упомянутые эксперименты свидетельствуют о ведущей роли мезодермы в процессе сегментации у Clitellata. Возможно, это касается и постларвального развития полихет, у которых метамеризация мезодермы происходит раньше метамеризации эктодермальных покровов. Однако это положение не находит подтверждения в отношении ларвального развития полихет. Вместе с тем, развитию ларвальной мезодермы полихет приписывают телобластический характер (Anderson, 1973; Shimizu, Nakamoto, 2001), что справедливо для клителлят, лишенных личиночной стадии, но не доказано для полихет. Таким образом, сравнение морфогенеза мезодермы лишь на уровне клеточных событий у полихет, с одной стороны, и у олигохет и пиявок, с другой, не дает возможности решить вопрос на сколько универсальны механизмов развития мезодермы в разных классах аннелид. Непонятно, являются ли мезотелобласты, обладающие свойствами стволовых клеток и дающие мезодерму всех сегментов, синапоморфией аннелид (которая по-разному реализуется морфологически) или они появились в эволюции позднее – лишь у клителлят.

1.2.2. Соматобласт 4d и организатор у Spiralia Соматобласт 4d и линия бластомеров, к нему приводящая, неразрывно связаны у Spiralia с эмбриональным организатором (Козин, Костюченко, 2016; Lambert, 2008).

Существование организатора у моллюсков было доказано экспериментами по удалению клеток квадранта D. У Ilyanassa obsoleta при этом нарушалось развитие не только производных удаленного бластомера, но отсутствовали и органы, происходящие из других клеточных линий (Clement, 1962). В случае удаления бластомера 3D эта ситуация изменялась при более позднем проведении операции (после определенного времени существования клетки 3D). Так был сделан вывод о том, что 3D индуцирует в соседних микромерах определенные клеточные судьбы (Рис.

11). Кроме того, в отсутствие клетки-организатора формируются радиализованные (не обладающие билатеральной симметрией) личинки (Clement, 1962). Наличие взаимных индуцирующих сигналов между будущим бластомером-организатором и анимальными микромерами было показано и для моллюсков с гомоквадрантным спиральным дроблением (Biggelaar van den, Guerrier, 1979; Henry et al., 2006).

Общепринято, что у моллюсков Ilyanassa, Patella, Lymnaea бластомероморганизатором является 3D, но некоторая активность сохраняется и у его дочерней клетки 4d (Lambert, 2008; Henry, 2014). Отлична ситуация гастроподы Crepidula fornicata, роль организатора у которой выполняет исключительно второй соматобласт 4d (Henry et al., 2006). У олигохеты Tubifex tubifex активностью организатора, повидимому, обладает совместное действие клеток – первого соматобласта 2d и второго соматобласта 4d (Nakamoto et al., 2011). У другой аннелиды – полихеты Capitella teleta способность индуцировать клеточные судьбы и устанавливать вторичную (дорсовентральную) ось тела заложена в бластомере 2d, но исчезает после его деления (еще до образования третьего квартета микромеров) (Amiel et al., 2013).

Рис. 11. Спецификация квадранта D и активность эмбрионального организатора у Spiralia (по Henry, 2014). A–D – гомоквадрантное спиральное дробление: определение линии D зависит от взаимодействия с соседними клетками (зеленые и красные стрелки в B). A’–D’ – гетероквадрантное спиральное дробление: судьба линии D определяется автономно за счет наследования материнских детерминантов (розовые точки), природа которых все еще не установлена. В обоих вариантах дробления бластомеры 3D и/или 4d активны как организатор (голубая заливка), который индуктивно определяет судьбы окружающих клеток (синие стрелки).

До недавнего времени конкретные молекулярные участники эмбриональной индукции у спиралий оставались загадкой. Первым установленным механизмом межклеточного взаимодействия у зародышей моллюсков стал сигналинг посредством MAP-киназы (Lambert, Nagy, 2001). MAP-киназный сигнальный каскад состоит из трех последовательно фосфорилирующих друг друга консервативных белков (Raf (MAPKKK), Mek (MAPKK), Erk (MAPK)) с киназным доменом и большого количества регуляторных факторов. Активированная MAP-киназа Erk (от англ. extracellular signal-related kinase), в свою очередь, фосфорилирует белки-мишени, которые принадлежат системам клеточного цитоскелета и метаболизма, пролиферации и дифференцировки, а локализуются эти эффекторы в цитоплазме, митохондриях, ЭПР и, в особенности, в ядре (Plotnikov et al., 2011; Yang et al., 2013). Этот каскад дифференциально активируется у зародышей гастропод Ilyanassa, Patella, Tectura, Testudinalia, Haliotis, Lymnaea и хитона Chaetopleura именно на стадии, когда наблюдается взаимодействие между клеткой 3D и анимальными микромерами (Lambert, Nagy, 2001; Lartillot et al., 2002a; Lambert, Nagy, 2003; Koop et al., 2007; Козин и др., 2013). Первоначально высокий уровень фосфорилированной формы MAPK обнаруживают в макромере 3D, однако в случае Ilyanassa сигнал вскоре появляется и в анимальных бластомерах, что говорит о распространении индукционного влияния, исходящего от организатора 3D. С этим согласуется и тот факт, что ликвидация макромера 3D нарушает нормальную активацию MAPK в соседствующих с 3D микромерах (Lambert, Nagy, 2001).

В экспериментах по фармакологическому подавлению MAP-киназного сигналинга на стадиях дробления у названных моллюсков нарушается развитие ряда структур, вплоть до полного повторения фенотипа личинок с удаленным организатором. Это обстоятельство приводит к выводу о том, что MAPK играет определенную роль в приобретении D квадрантом идентичности и в обеспечении его активности как организатора (Lambert, 2008; Henry, 2014; Козин, Костюченко, 2016).

Примечательно, что у гастроподы Crepidula самая ранняя и очень слабая активация MAPK показана в микромерах первого квартета, еще до рождения 3D (Henry, Perry, 2008). Для Crepidula и другой гастроподы с гомоквадрантным спиральным дроблением Testudinalia testudinalis определено, что к наиболее серьезным нарушениям развития приводит подавление фосфорилирования MAPK на стадиях до формирования макромера 3D (Козин и др., 2013). Возможность существования ранних взаимодействий, детерминирующих D квадрант, между макромерами и микромерами активно обсуждается в последнее время (Gharbiah et al., 2014; Henry, 2014). Также становится очевидным, что каскад MAPK – не единственный путь межклеточной коммуникации, участвующий в определении клеточных судеб и осей тела в ходе раннего развития у спиралий (Козин и др., 2013; Gharbiah et al., 2014; Pruitt et al., 2014).

Важно отметить, что у полихеты Hydroides активация MAPK была выявлена не в макромере 3D, а в соматобласте 4d (Lambert, Nagy, 2003). Выбивающимся из описанного ряда спиралий является случай червя Capitella teleta, фосфорилированная форма МАР-киназы у которой появляется вокруг бластопора относительно поздно – в период гаструляции (Amiel et al., 2013). Поскольку имеющиеся на сегодняшний момент данные говорят о заметных отличиях в работе МАР-киназного сигналинга у разных видов, первоочередная задача состоит в получении репрезентативной картины с использованием большего числа объектов. Безусловно, это будет способствовать пониманию эволюции и степени консерватизма механизмов определения клеточных судеб и осевых отношений в развитии Spiralia.

1.2.3. Экспрессия молекулярно-генетических маркеров – возможных детерминантов развития мезодермы аннелид и моллюсков Помимо исключительно мезодермальных маркеров Twist и Mox (см. разделы 1.1.4 и 1.1.5) у представителей Spiralia был выявлен целый ряд генов с доменами экспрессии в мезодермальных зачатках. Условно эти гены можно разделить на три группы:

бластопоральные/мезэнтодермальные гены (FoxA, Goosecoid, Brachyury, GATA);

маркеры клеток половой линии и мультипотентных/стволовых клеток (гены GMP (germline multipotency program) Vasa, Piwi, Nanos);

гены сегментации (Delta, Notch, Hairy, Evx, Runx).

У широкого круга животных гомологи ТФ FoxA, Goosecoid, Brachyury, GATA чаще всего экспрессируются в районе центра гаструляции (бластопора) в клетках с интестинальной и/или мезодермальной судьбой. У полихет Hydroides, Capitella и базальных аннелид Themiste (Sipunculida), Chaetopterus гомологи гена FoxA (“Forkhead box” A) начинают экспрессироваться с ранних стадий эмбриогенеза в вегетативных бластомерах (Arenas-Mena, 2006; Boyle, Seaver, 2008; Boyle, Seaver, 2010). Во время гаструляции домены экспрессии FoxA вокруг бластопора включают как поверхностные (презумптивные стомоидальные), так и погружающиеся вглубь (презумптивные энтодермальные) клетки. На личиночных стадиях экспрессия в средней кишке у изученных аннелид заметно ослабевает или исчезает вовсе, зато интенсивная транскрипция FoxA наблюдается в стомодеуме (зачаток передней кишки) и, иногда, – проктодеуме. Кроме того, для Hydroides отмечена непродолжительная экспрессия одного из паралогов FoxA в эктомезодерме (предположительно зачатке т.н. головной почки – протонефридиях) (Arenas-Mena, 2006).

В эктомезодермальных клетках, лежащих спереди и по бокам от бластопора, также обнаружена экспрессия ортологов FoxA и Goosecoid у моллюска Patella vulgata (Lartillot et al., 2002b). В связи с этим авторы гомологизируют эктомезодерму спиралий с прехордальной пластинкой позвоночных. Однако у другой гастроподы – Haliotis rufescens – экспрессия FoxА была локализована только в эктодермальных частях кишки

– стомодеуме и проктодеуме (Dunn et al., 2007). FoxА также широко транскрибируется у Patella в стомодеуме и энтодерме, а Goosecoid – в стомодеуме и эктодерме мантийной складки (Lartillot et al., 2002b). Экспрессия Goosecoid в развитии Capitella приурочена исключительно к эктодермальным клеткам, расположенным спереди от области бластопора ранних зародышей (Boyle et al., 2014). Позднее сигнал мРНК выявляется в поверхностных клетках вокруг стомодеума и в ассоциированных с передней кишкой глубинных нейронах. У полихеты P. dumerilii экспрессию Goosecoid изучали лишь на стадиях трохофорной личинки и обнаружили транскрипты этого гена в стомодеуме и двух прилегающих к нему с боков группах клеток, предположительно нейральной природы (Arendt et al., 2001).

Гомолог Brachyury у ранних зародышей Capitella экспрессируется в большинстве бластомеров, но с разной интенсивностью (Boyle et al., 2014). В ходе гаструляции мРНК распределяется по клеткам, примыкающим к бластопору с разных сторон, причем, учитывая глубину залегания, в этом паттерне выявляется некоторая асимметрия. На личиночных стадиях экспрессия Brachyury наиболее ярко проявляется на задней стороне стомодеума и на самом заднем полюсе тела, и в меньшей степени – в преоральной эктодерме и внутренних энтодермальных и мезодермальных тканях. У поздних сегментированных личинок Capitella ген активно транскрибируется в передней и задней кишке, а также в головном мозге и мезодермальных полосках (Boyle et al., 2014). Похожий паттерн активности Brachyury, охватывающий заднюю границу стомодеума, клетки вентромедиальной линии, проктодеум и среднюю кишку, известен для личинок P. dumerilii (Arendt et al., 2001). Гомолог Brachyury был выделен и у полихеты Hydroides elegans, обладающей гомоквадрантным дроблением и питающейся трохофорной личинкой, что, несомненно, является примитивными признаками. Во время гаструляции Hydroides Аренас-Мена (Arenas-Mena, 2013) отмечает динамичную экспрессию Brachyury в клетках архентерона – сначала по центру инвагинации, а затем в крае бластопора. На основе сравнительного анализа автор предполагает, что brachyury у спиралий связан не со спецификацией кишки, а с морфогенетическими движениями гаструляции. Очень кратковременной экспрессией обладает гомолог Brachyury у олигохеты Tubifex, проявляясь в клетках третьего квартета микромеров (проспективный стомодеум) с момента их рождения до деления и на гораздо более поздних стадиях – в проктодеуме (Kitakoshi, Shimizu, 2010). В развитии моллюска Patella vulgata ген Brachyury начинает экспрессироваться со стадии детерминации бластомера-организатора 3D как раз в этой клетке (Lartillot et al., 2002a).

Позднее сигнал распространяется на соседние бластомеры – 3c, 3d (и их потомки), а также непродолжительное время остается в дочерних клетках 3D – 4D и 4d. По мере замыкания бластопора Brachyury экспрессируется вдоль его задней границы – от задней оконечности стомодеума по вентромедиальной линии до проктодеума (Lartillot et al., 2002a).

Гомологи Zn-фингерных ТФ GATA у билатеральных животных формируют две подгруппы паралогов – GATA1/2/3 и GATA4/5/6. В пределах каждой из подгрупп у отдельного вида встречается от одного до нескольких гомологичных последовательностей, что чаще всего является особенностью в пределах филогенетической линии относительно низкого порядка. Гомологи GATA1/2/3 экспрессируются у Bilateria в эктодермальных тканях, а представители подгруппы GATA4/5/6 – в мезэнтодермальных клетках. У аннелид Chaetopterus, Themiste, P.

dumerilii и Capitella обнаружено от 1 до 3 паралогов GATA4/5/6, отличающихся своей тканеспецифичностью. У Chaetopterus, Themiste и Capitella хотя бы по одному из генов GATA4/5/6 экспрессируется и в энтодерме, и в части прилегающих к кишке мезодермальных клеток (Boyle, Seaver, 2008; Boyle, Seaver, 2010). При этом отмечается, что на ранних стадиях развития экспрессия этих генов происходит во всем четвертом квартете микромеров, за исключением клетки 4d. Напротив, у полихеты P. dumerilii единственный выявленный представитель GATA4/5/6 обнаруживает свою активность в М-клетках и повсеместно в мезодермальных полосках – производных 4d (Gillis et al., 2007). Один из паралогов GATA4/5/6 у Capitella (CapI-gataB3) также имеет исключительно мезодермальную тканеспецифичность, а другой (CapI-gataB1), равно как и Tl-GATA456a у Themiste, – экспрессируется только в пределах средней кишки.

Резюмируя приведенные данные по активности “бластопоральных” генов у Spiralia, следует отметить большую вариабельность их тканеспецифичности, что говорит не в пользу их анцестральной и консервативной роли в развитии того или иного зародышевого листка или зачатка. В разных группах червей и моллюсков диверсификация планов строения и более тонких черт шла, скорее всего, на основе приобретения каждым геном-ортологом своего неповторимого регуляторного аппарата и закрепления уникальной функции в развитии. На личиночных стадиях, по большей части, эти гены участвуют в молекулярной разметке кишки и соседствующих тканей. Их активность вокруг бластопора (в период раннего развития) наталкивает на мысль о возможной роли в паттернировании зародыша и контроле над морфогенетическими движениями гаструляции.

*** К другой представляющей для нас интерес группе генов, составляющих т.н. GMP (“germline multipotency program”, или кратко “germline genes”), относятся Vasa, Piwi, Nanos и их выше- и нижележащие партнеры. Vasa, Piwi и Nanos кодируют не ТФ, а белки, взаимодействующие с молекулами РНК, и считаются регуляторами трансляции.

У Metazoa гены GMP играют ключевою роль в развитии клеток половой линии и дифференциально экспрессируются в них со стадий ППК до зрелых ооцитов (Extavour, 2007; Ewen-Campen et al., 2009; Shukalyuk, Isaeva, 2013). В ходе раннего эмбриогенеза зачастую продукты этих генов сегрегируются в определенные бластомеры, предопределяя развитие полового зачатка.

У всех Spiralia за исключением планарий исследования динамики экспрессии GMP генов указывают на их активность именно в клеточной линии 4d, из которой и выделяются ППК. В мезодермальных полосках у зародышей и трохофор моллюсков Ilyanassa и Haliotis была обнаружена дифференциальная экспрессия генов Vasa, PL10 и Nanos (Rabinowitz et al., 2008; Swartz et al., 2008; Kranz et al., 2010). Примечательно, что и у полихеты Capitella мезодермальные полоски, которые, как известно, образуются из клеток 3c и 3d, также экспрессируют гомологи Vasa, Piwi и Nanos вплоть до завершения сегментации личинки (Dill, Seaver, 2008; Giani et al., 2011). У поясковых аннелид (олигохеты Tubifex и пиявки Helobdella) транскрипты генов Piwi и паралогичных Vasa и p68 длительное время обнаруживаются и в мезотелобластах, и в первичных бластных клетках зародышевой полоски (Oyama, Shimizu, 2007; Oyama et al., 2008; Cho et al., 2014). Как правило, на поздних стадиях развития экспрессия GMP генов у аннелид сохраняется лишь в ППК и зоне роста, но может возникнуть de novo в клетках разных зародышевых листков в ходе регенерации и бесполого размножения (Костюченко и др., 2016; Giani et al., 2011; Kozin, Kostyuchenko, 2015).

У нереиды P. dumerilii антитела к белку Vasa проявляют иммунореактивность в бластомере 4d и позднее – в происходящих из него клетках вторичного мезобласта, включая четыре ППК (Rebscher et al., 2007; Rebscher et al., 2012). Поскольку экспрессия маркеров мультипотентности в мезодермальных полосках и эктомезодерме у нереид осталась неописанной, эта задача была включена в настоящую работу. Для более полного понимания возможных функций данных генов интереса далее будут кратко рассмотрены их характерные черты.

Представители DEAD-бокс РНК-хеликаз (Vasa, PL10) характеризуются наличием девяти консервативных мотивов, один из которых – DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) – и дал название семейству этих белков (Linder, 2006). Функция DEAD-бокс содержащих РНКхеликаз состоит в расплетении двухцепочечной РНК, что связана с разнообразными процессами метаболизма РНК: транскрипцией, сплайсингом, транспортом, трансляцией, деградацией и поддержанием стабильности специфических транскриптов, биогенезом рибосом (Cordin et al., 2006). По особенностям первичных последовательностей выделяют несколько подгрупп DEAD-бокс РНК-хеликаз, в частности, белки P68, подсемейство DDX3/PL10 и группу Vasa-подобных белков (DDX4/Vasa). Распространенный от бактерий до человека ген PL10, согласно филогенетическому анализу, является анцестральной последовательностью, дупликация которой произошла перед появлением губок и привела к возникновению Vasa, встречающемуся только у Metazoa (Mochizuki et al., 2001).

Экспрессия гомологов Vasa и PL10 приурочена к малодифференцированным и стволовым клеткам, хотя конкретные молекулярные пути поддержания стволовой с участием DEAD-бокс РНК-хеликаз остаются непонятыми. Изначально ген Vasa был идентифицирован у дрозофилы как материнский фактор паттернирования постериорных структур и спецификации первичных половых клеток (Schupbach, Wieschaus, 1986). Обнаружение в детерминантах полового пути (полярных, половых гранулах, нюаж, хроматоидных телах) и экспрессия гомологов Vasa в клетках половой линии была показана для многих животных (Исаева и др., 2007; Extavour, Akam, 2003).

Однако с накоплением наших знаний о DEAD-бокс РНК-хеликазах все чаще постулируется более широкая закономерность приуроченности их экспрессии именно к мультипотентному и малодифференцированному состоянию клетки (Juliano, Wessel, 2010; Wu et al., 2011). Кроме того, функциональная необходимость гомологов PL10 была выявлена для почкования колониальной асцидии Botryllus schlosseri, жизнеспособности и личиночного роста дрозофилы. Гомологи Vasa также экспрессируются в почках Botryllus schlosseri, в зоне деления олигохеты Pristina longiseta (Костюченко и др., 2016), в клеточных источниках регенерации гонад после нереста устрицы, малых микромерах и рудименте дефинитивного тела (левом гидроцеле) в развитии морского ежа, хвостовой почке ланцетника и ряде других мультипотентных клеток (Gustafson, Wessel, 2010).

Белки Piwi являются подгруппой семейства Argonaute – участников микроРНКопосредованного пути регуляции экспрессии генов (Cox et al., 1998). Гомологи Piwi характеризуются наличием PAZ и PIWI доменов, первый из которых связывается с 3' концом особого класса микроРНК – piRNA, а второй гомологичен РНКазе Н и отвечает за эндонуклеазную активность. Одной из первых установленных функций белков Piwi была защита генома клеток половой линии от экспансии транспозонов, однако позднее были получены данные об участии Piwi в регуляции транскрипции и трансляции (Thomson, Lin, 2009).

Важным аспектом экспрессии некоторых гомологов Piwi является их обнаружение в половых детерминантах (нюаж, полярная плазма), где они колокализуются и физически взаимодействуют с Vasa, регулируя активность друг друга (Gustafson, Wessel, 2010). Подобно Vasa, экспрессия гомологов Piwi была найдена не только в развивающихся половых клетках, но и в ряде мультипотентных стволовых элементов губок, книдарий, гребневиков, плоских червей, асцидий (Reddien et al., 2005;

Funayama et al., 2010; Ali et al., 2011; Juliano et al., 2011). Следует особо отметить, что функциональный тест чаще всего выявляет необходимость Piwi для самоподдержания и обновления таких клеточных популяций.

*** Некоторые гены, выполняющие исключительно важную и весьма консервативную роль в сегментации тела артропод, были идентифицированы и у аннелид. Гомологи генов сегментации Delta, Notch, Hairy, Evx, Runx, Odd у червей имеют достаточно дифференциальные паттерны экспрессии с большим количеством доменов в различных зародышевых листках. Вместе с тем, экспрессия в мезодермальных полосках, например, некоторых паралогов из суперсемейства Hairyподобных ТФ у Capitella и P. dumerilii говорит об эволюционно закрепленной функции этих генов (Thamm, Seaver, 2008; Gazave et al., 2014). Ген Hairy является одной из канонических мишеней Delta/Notch-сигналинга. Поскольку сигнальные пути могут вовлекаться в разнообразные морфогенетические программы развития, неудивительно, что его компоненты обнаруживаются в зачатках ЦНС, кишки, мезодермальных полосках и зоне роста у Capitella (Thamm, Seaver, 2008). Также хорошо известно, что сам Hairy в пресомитной мезодерме позвоночных создает транскрипционный осциллятор, чрезвычайно похожий на таковой с участием eve, runt и odd у артропод (Richmond, Oates, 2012).

Гомологи hairy, eve, runt и odd функционально объединяются у насекомых под названием “гены правила парности” и составляют наиболее консервативный модуль программы сегментации. Паттерны их экспрессии в мезодерме у зародышей и личинок Capitella проявляют признаки метамерности (Layden et al., 2010; Seaver et al., 2012), хотя указанные авторы склонны отрицать общность механизмов сегментации аннелид и артропод. У других модельных объектов среди аннелид – пиявок – экспрессия Evx была приурочена к зародышевым полоскам, включая и эктодермальные, и мезодермальные (Song et al., 2002). В то же время, транскрипция Evx полихеты P.

dumerilii описана исключительно в эктодермальных производных (de Rosa et al., 2005).

Безусловно, для сколько-нибудь уверенных выводов касательно роли обсуждаемых генов в развитии мезодермы и сегментации тела аннелид необходимы функциональные методы анализа и выяснение степени универсальности этой программы развития на репрезентативной выборке объектов.

1.3. Краткий обзор развития полихет как модельных объектов Объектами нашего исследования послужили нереидные полихеты (сем.

Nereididae) Alitta virens (M. Sars, 1835) (ранее именовавшийся Nereis virens и Neanthes virens) и Platynereis dumerilii (Audouin & Milne Edwards, 1834) (первоначальное название

– Nereis dumerilii). Эти виды имеют длительную историю изучения, связанную с различными отраслями биологии. Наиболее активно в данный момент исследуется их развитие и нейробиология, поскольку эти данные чрезвычайно актуальны для эволюционных построений (Fischer, 1999; Fischer, Dorresteijn, 2004; Simakov et al., 2013;

Williams, Jkely, 2016).

Для Alitta virens и Platynereis dumerilii характерна семельпария – единственный акт размножения, происходящий во время нереста (роения), после которого животные погибают. С такой жизненной стратегией связано производство огромного количества гамет. Нереиды выметывают в морскую воду тысячи ооцитов, которые после оплодотворения претерпевают синхронное развитие вплоть до поздних личиночных стадий (Рис. 12). Возможность получения столь удобного и объемного эмбрионального материала предопределила популярность нереид в качестве модельных объектов.

Рис. 12. Жизненный цикл P. dumerilii (Dorresteijn et al., 1993). Гаметы выметываются в морскую воду, где происходит оплодотворение, эмбриогенез и ларвальное развитие.

Сферическая личинка трохофора имеет планктонный лецитотрофный образ жизни. На смену ей в ходе плавного эволютивного метаморфоза приходят метамерные формы – метатрохофора и нектохета. Последняя оседает на дно и за счет анаморфного роста превращается в бентосного многосегментного ювенильного червя. На завершающем этапе онтогенеза происходит эпитокная трансформация, и половозрелые особи переходят к нересту в поверхностном слое воды, после чего погибают.

Для Alitta virens и Platynereis dumerilii созданы таблицы нормального развития и регенерации (Костюченко, Дондуа, 2006; Kulakova et al., 2007; Fischer et al., 2010; Козин и др., 2017), существуют EST-библиотеки кДНК и геномные ВАС-библиотеки (https://bacpacresources.org/library.php?id=209). У культивируемого в лабораторных условиях Platynereis dumerilii секвенированы, хотя большей частью и не опубликованы, геном и разнообразные транскриптомы (http://4dx.embl.de/platy; NCBI).

Особенности развития и репродукции полихет привлекают интерес исследователей уже на протяжении более полутора столетий. Классические описательные работы Мечникова, Гатчека, Вильсона и др., вышедшие еще в 19-м веке, заложили основы нашего понимания онтогенеза и эволюции аннелид, а во многом актуальны и по сей день (Wilson, 1892). Следующее поколение эмбриологов (Лилли, Чайлд, Иванов, Костелло) широко применяло экспериментальный подход, что помогло вскрыть внутренние закономерности развития аннелид в норме и при регенерации (Iwanoff, 1928; Costello, 1945). При этом были обоснованы фундаментальные проблемы детерминации, дифференцировки, морфогенеза и эволюции многоклеточных животных.

Что же обеспечило такую популярность кольчатых червей и плодотворность их изучения? Прежде всего, стоит отметить близость ряда групп (в первую очередь эррантных полихет) к анцестральному состоянию Bilateria. Консервативными признаками, унаследованными от общего предка билатеральных животных, принято считать раннекембрийское происхождение, обитание в морской среде, план строения сегментированного тела, амфистомию, определенный набор семейств генов, соотношение паттернов их экспрессии и ряд особенностей организации генома. Как было выяснено, все эти черты ярко выражены у нереидных полихет, что связывают с малой скоростью их эволюции (Raible et al., 2005; Zantke et al., 2014). Нереид часто называют “живыми ископаемыми”, подчеркивая их преимущества над хорошо разработанными, но эволюционно продвинутыми модельными объектами среди беспозвоночных – дрозофилой, нематодой C. elegans, асцидией Ciona, которые независимо утратили некоторые древние признаки, сохранившиеся в измененном состоянии даже у позвоночных. Такая ситуация делает нереид более предпочтительным объектом для изучения в сравнительном аспекте.

В филогенетической системе аннелид нереиды относятся к кладе Errantia парафилетического класса Polychaeta (Struck et al., 2011). Среди полихет насчитывается до 10000 видов, сгруппированных примерно в 80 семейств. Это почти исключительно морские животные, являющиеся наиболее древними и разнообразными представителями типа Annelida. Эмбриональное развитие полихет проходит по спиральному типу, в результате которого обычно образуется планктонная несегментированная личинка трохофора. Следует отметить, что этапы дробления, гаструляции и личиночных органогенезов часто накладываются друг на друга. Тело трохофоры в процессе метаморфоза разделяется на сегменты, именуемые ларвальными. Далее, из субтерминальной зоны роста ювенильного червя начинают образовываться постларвальные сегменты (Иванова-Казас, 1977; Anderson, 1973). Во взрослом состоянии полихеты обладают хорошо выраженными способностями к регенерации.

Полихеты, как и все аннелиды, а также турбеллярии, немертины и моллюски относятся к группе животных со спиральным типом дробления. На ранних стадиях развития зародышам этих животных присуща так называемая региональная гомология, так как имеет место значительное сходство генеалогии и проспективного значения бластомеров (Иванова-Казас, 1977). Из-за стереотипного характера дробления и ранней сегрегации клеточных линий развитие спиральных принято считать в большой мере детерминативным (или мозаичным), т.е. развитием с преобладанием механизмов автономной детерминации. В случае гетероквадрантного спирального дробления, как у нереид, уже после первого деления зиготы можно различить большой бластомер CD и малый – AB. В результате второго деления дробления образуется квартет бластомеров A, B, C и D. Начиная с третьего раунда деления, эти бластомеры отделяют от себя в сторону анимального полюса под углом приблизительно в 45° к анимально-вегетативной оси квартеты микромеров, а сами они получают наименование макромеров. Отделение микромеров от макромеров происходит то по, то против часовой стрелки, в результате чего создается впечатление, что микромеры расположены по спирали (Иванова-Казас, 1977; Anderson, 1973).

Все потомки одного из бластомеров на четырехклеточной стадии слагают один из четырех квадрантов. Ключевую роль в развитии спиральных играет квадрант D. В бластуле Spiralia существуют две особые клетки – 2d и 4d (первый и второй соматобласт соответственно). 2d в результате развития даст почти всю эктодерму тела животного, а 4d является клеткой-родоначальницей мезодермы сегментов червя, которую называют энтомезодермой. 4d появляется в ходе 6-го деления дробления (в случае синхронности делений – на стадии 64 клеток) и занимает в бластуле дорсокаудальное положение. В результате его симметричного деления образуется две М-клетки (мезотелобласта), деление которых приводит к формированию в теле трохофорной личинки двух мезодермальных полосок (Рис. 13). Пролиферации М-клеток полихет часто приписывают телобластический характер (Anderson, 1973; Shimizu, Nakamoto, 2001), однако не существует ни одной работы, где это было бы однозначно показано (см.

раздел 1.2.

1). Предполагается, что мезотелобласты полихет делятся асимметрично и дают ряд мелких клеток, слагающих мезодермальные полоски, а сами занимают при этом терминальное положение и сохраняются как недифференцированные стволовые клетки (резидуальные телобласты) и у личинки трохофоры, и у ювенильного червя.

Рис. 13. Клеточные линии и их производные у P. dumerilii (по Ackermann et al., 2005;

Fischer, Arendt, 2013). А – зародыш на стадии перехода к билатеральному дроблению (49 бластомеров), вегетативная проекция. Зачаток энтомезодермы – мезотелобласты (М-клетки) – лежат на дорсальной границе презумптивного бластопора. Б – ранняя трохофора (24 чпо), вентральная проекция. Сверху показано расположение ядер в МП, снизу – фронтальная конфокальная проекция окрашенных с помощью DAPI ядер, МП обведены пунктиром. В – клеточные домены (справа приведено соответствие цвета и клеточной линии) в теле нектохеты (96 чпо), передний конец направлен в нижний правый угол. Сверху – дорсальная поверхность, снизу – фронтальный срез.

Энтомезодерма (темно-оранжевый) формирует мышечный слой стенки тела между энтодермальной кишкой (серый) и покровной эктодермой (светло-оранжевый).

Звездочка – область стомодеума/глотки.

Кроме энтомезодермы у полихет выделяют эктомезодерму (личиночную мезенхиму), в состав которой у разных видов полихет входят второй и/или третий квартет микромеров. Производными эктомезодермы являются обкладка глотки и мышцы головы. У нереидных полихет эктомезодерму слагают микромеры третьего квартета 3a–3d (Wilson, 1892; Ackermann et al., 2005).

После завершения шестого деления дробления у нереид образуется бластула без полости – стерробластула. Презумптивный бластопор располагается на вегетативном полюсе бластулы и несколько сдвинут на брюшную сторону. Его край слагают М-клетки, эктомезодермальные бластомеры 3a–3d и микромеры второго квартета 2a2–2d2 (Рис. 13). На дорсальной стороне зародыша лежат потомки эктодермального соматобласта 2d. Центральное положение в бластуле занимают четыре макромера (4А–4D) – материал средней кишки.

Гаструляция у нереид осуществляется путем эпиболии, при которой клетки эктодермы обрастают макромеры и мезодермальные бластомеры. Основным движением гаструляции является перемещение клеток-потомков микромера 2d со спинной на брюшную сторону. Это движение эктодермальных клеток огибает латеральные стороны зародыша в виде двух встречных потоков, а на месте их встречи на вентральной стороне формируется вегетативная пластинка (Wilson, 1892; Steinmetz, 2006). При этом происходит образование щелевидного бластопора (сначала принимающего форму цифры 8) и оттеснение его переднего края в переднебрюшном направлении, где позже сформируется стомодеум (зачаток передней кишки). Задний край бластопора закрывается эктодермой, из которой образуется проктодеум (зачаток задней кишки). Такую картину замыкания бластопора, на месте которого образуется и рот и анус, принято называть амфистомией. На вегетативном полюсе продукты деления М-клеток дают начало мезодермальным полоскам. Приблизительно по экватору зародыша дифференцируется ряд ресничных клеток – прототрох.

Типичной личиночной формой полихет является шаровидная пелагическая личинка трохофора. Ее основной локомоторный орган – прототрох – делит тело личинки на два полушария: верхнее, называемое эписферой, и нижнее, называемое гипосферой. В процессе дальнейшего развития эпителий эписферы даст начало зачатку головного мозга, а сама эписфера превратится в головную лопасть (простомиум) (Иванова-Казас, 1977; Anderson, 1973).

Нижнее полушарие трохофоры содержит как зачатки головы, так и элементы туловища взрослого животного. Непосредственно под прототрохом на вентральной стороне гипосферы расположен личиночный рот – стомодеум. По бокам от стомодеума во внутренних тканях залегают клетки эктомезодермы. Эпителий гипосферы в основном представляет собой результат пролиферации первого соматобласта 2d.

Вегетативная пластинка на вентральной поверхности дает в основном нейроэктодерму

– зачаток ЦНС. По бокам трохофоры под эпителием расположены две симметричные мезодермальные полоски. Самым внутренним является зачаток средней кишки – макромеры четвертого квартета и, возможно, небольшая часть потомков 4d (Wilson, 1892; Wilson, 1898; Ackermann et al., 2005).

Каудально в теле личинки располагается область задней кишки и анальной лопасти (пигидия), окруженной венчиком ресничек, называемого телотрохом.

Некоторые авторы (Anderson, 1973; Shimizu, Nakamoto, 2001; de Rosa et al., 2005) считают, что кпереди от телотроха личинки существует ряд стволовых клеток – резидуальных эктотелобластов, являющихся зачатком всей постларвальной эктодермы. Резидуальные эктотелобласты представляют собой недифференцированную ранее в эмбриогенезе линию клеток – потомков первого соматобласта 2d. Под кольцом эктотелобластов по описанию Андерсона (Anderson,

1959) у своеобразной трохофоры Scoloplos armiger залегают два резидуальных мезодермальных телобласта – потомки второго соматобласта 4d. Эти парные клетки занимают терминальное положение в мезодермальных полосках и считаются предшественниками в том числе и постларвальной мезодермы. Вместе с кольцом эктотелобластов пара мезотелобластов составляют по этому сценарию зону роста, из которой еще до завершения метаморфоза продолжают отделяться новые сегменты тела. Как полагают, такая же организация зоны роста сохраняется и после метаморфоза при формировании постларвальных сегментов.

Следует отметить, что описанная картина не является достоверно подтвержденной для всех полихет. Лишь у видов из отдельных семейств, откладывающих яйца с малым содержанием желтка, в каудальной области трохофоры можно наблюдать относительно большие и, в отличие от остального эпидермиса, недифференцированные (резидуальные) эктотелобласты (Anderson, 1973). В противном случае, когда зародыши (эмбрионизированные трохофорные личинки) богаты желтком и зачастую развиваются не в планктоне, а в кладках (Amphitrite, Arenicola, Clymenella, Capitella, Scoloplos, Tomopteris, Eunice), телотрох может присутствовать, но почти все клетки эпителия гипосферы, также как и эктотелобласты, остаются недифференцированными, а, следовательно, неотличимыми от последних.

Классические работы по эмбриологии нереидных полихет (Wilson, 1892) также не дают прямого доказательства существования особой линии эктотелобластов, хотя их наличие дается как предположение.

В соответствии с альтернативной точкой зрения (Iwanoff, 1928; Иванов, 1944;

Беклемишев, 1964; Иванова-Казас, 1977), описанная выше зона роста у трохофор, по крайней мере, в нескольких семействах полихет, отсутствует. В результате делений первого и второго соматобластов не происходит сохранения особой линии недифференцированных стволовых клеток эктодермы и мезодермы постларвальных сегментов. Согласно П. П. Иванову зона роста полихет формируется в результате метаморфоза – превращения трохофоры в ювенильного червя.

Процесс метаморфоза у разных полихет может варьировать, и поэтому кроме трохофорной личинки принято выделять еще несколько переходных форм, которые могут встречаться в жизненном цикле некоторых полихет. Сама трохофора характеризуется отсутствием каких-либо признаков сегментации и ведет планктонный образ жизни. Планктонную личинку, имеющую признаки сегментации (метамерно расположенные ресничные кольца паратрохи и хетоносные мешки) называют метатрохофорой. С момента появления функционально активных локомоторных придатков параподий до образования первого постларвального сегмента личинка носит название нектохеты. Кроме того, на стадии нектохеты начинают развиваться головные придатки, характерные для взрослого червя (антенны, перистомиальные усики), а сама личинка переходит к донному образу жизни.

Таким образом, процесс метаморфоза полихет включает в себя несколько составляющих:

• метамеризация гипосферы;

• редукция личиночных и развитие дефинитивных органов;

• переход от плавающего образа жизни к донному.

Рассмотрим первый пункт более подробно. Общепринято, что в первую очередь метамеризации подвергаются эктодермальные производные (Иванов, 1944;

Беклемишев, 1964; Иванова-Казас, 1977). Появление посегментно расположенных паратрохов и хетоносных мешков довершается образованием параподиев, нервных ганглиев и внешних границ между сегментами в виде бороздок. Неметамерными в теле метатрохофоры являются эписфера (будущий простомиум) и анальная лопасть (пигидий). В отличие от эктодермы, мезодермальные полоски могут оставаться однородными вплоть до стадии нектохеты (Беклемишев, 1964). К тому же в зоологической литературе обосновано, что расчленение мезодермальных полосок происходит не самостоятельно, а под влиянием метамерного расположения других органов, таких как зачатки параподий или пучки мезенхимных мышц. Однако существуют и исключения. Так, у Scoloplos armiger целомические мешки образуются еще до сегментации эктодермальных покровов (Anderson, 1973).

Принципиальные различия в строении и развитии мезодермы ларвальных сегментов полихет послужили основой для теории П. П. Иванова о первичной гетерономности тела (Iwanoff, 1928; Иванов, 1944). Это теоретическое обобщение в области эмбриологии сравнимо по значимости с теорией зародышевых листков.

Последовавшая критика теории Иванова значительно сузила границы ее применимости, фактически оставив бесспорным гетерономность сегментов лишь у нескольких семейств полихет (Иванова-Казас, 1977; Anderson, 1973). Тем не менее, проблема строения, индивидуального и исторического развития сегментированных животных по сей день остается предметом дискуссий (Shimizu, Nakamoto, 2001; Tautz, 2004; Couso, 2009).

Как мы могли убедиться, формирование мезодермы и ее производных остается во многом неизученным, но принципиально важным вопросом для эмбриологии и эволюционной биологии. Качественно новые методы анализа могли бы прояснить многие частные и общие закономерности развития мезодермы Spiralia. Нереидные полихеты представляются удобной и перспективной моделью для подобных исследований.

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Использованная техника и материалы Оборудование Флуоресцентные микроскопы Axio Imager D1 и Axioplan2 (Carl Zeiss);

конфокальные микроскопы LSM 510 (Carl Zeiss), TCS SP5 (Leica Microsystems);

инвертированный микроскоп Leica DM IL (Leica Microsystems);

микроинжектор FemtoJet Express (Eppendorf);

микроманипулятор TransferMan NK2 (Eppendorf);

термоциклеры Bio-Rad Т100, Quattro Chassi (VWR);

микроцентрифуги MicriCen 13A (Herolab), Eppendorf 5424R, Heraeus Pico 17 (Thermo Scientific);

твердотельные термостаты Гном (ДНК-Технология), BioSan CH-100, Thermomixer Compact (Eppendorf);

спектрофотометры NanoDrop (Peqlab), SmartSpec Plus (Bio-Rad);

камеры для горизонтального электрофореза AGT2 (VWR), MSMINI (Biozym), Helicon SE-2;

источники питания VWR 250V, Эльф-8 (ДНК-Технология);

система гель-документации Alphaimager HP (Biozym).

Векторы, плазмиды и компетентные бактериальные клетки Рутинное клонирование амплифицированных фрагментов ДНК производили в коммерческие векторы с тупыми концами – pJET1.2 (Thermo Scientific) и с липкими концами – pGEM-T, pGEM-T Easy (Promega), pCRII-TOPO (Invitrogen). С помощью стандартных праймеров М13 с полученными плазмидами проводили секвенирование и транскрипцию in vitro для синтеза РНК-зондов, используемых в гибридизации in situ.

Для получения мРНК, пригодной для инъекций в зародыши, кДНК клонировали в вектор pCS2+ (Addgene). Для конструирования последовательностей TALEN использовали набор плазмид Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0 (Addgene 1000000024) и векторы доставки pCS2TAL3-DD и pCS2TAL3-RR (Addgene 37375, 37376).

Плазмиды для трансгенеза с помощью транспозона Mos1 – pMos{rps9::egfp}frkt1074 и pCS2+Mos1frkt574 были сконструированы и предоставлены Б.

Бэкфишем и Ф. Райбле (Backfisch et al., 2013; Backfisch et al., 2014). Для ВАСрекомбинации использовались плазмиды pRedFlp4 (frkt#893) и pR6K-E2N-FRT (frkt#894) (Ejsmont et al., 2009), piTol2-kan (frkt#979) (Suster et al., 2011), полученные от соответствующих авторов. Плазмиды, содержащие RACE-фрагменты гомологов Twist (rk155), Avi-evx (rk322), Vasa (rk242, rk235, rk236), PL10 (rk139, rk263) и Piwi (rk229, rk230, rk232) у A. virens, были получены и предоставлены Р.П. Костюченко. В ходе выполнения настоящей работы были клонированы и архивированы плазмиды с фрагментами генов Avi-mox (frkt#1292), Avi-evx (rk322, frkt#1293), Avi-piwi1 (pi-6, pi-49), Pdu-twist (frkt#1288), Pdu-mox (mo-50-2), Pdu-evx (frkt#1287), экспрессионные векторы с TALEN к Pdu-twist twiL (frkt#1299), twi-1R (frkt#1300), twi-2L (frkt#1301), twi-2R (frkt#1302), twi-3L (frkt#1363), twi-3R (frkt#1364), а также репортерная трансгенная конструкция pTol{Avi-twist::eGFPF2A-NTR}. Регистрационные номера полноразмерных последовательностей генов интереса в базе NCBI: Avi-twist – JN107993, Avi-mox – KU052761, Avi-evx – KU052760, Avivasa – KM406469, Avi-pl10 – KM406470, Avi-piwi1 – KM406471, Avi-piwi2 – KM406472.

Для трансформации использовали химически компетентные клетки E. coli One Shot TOP10 (Invitrogen) и XL1-Blue. ВАС-клоны, подвергавшиеся электропорации, относились к штамму E. coli DH10B.

Культуры животных Нерестящихся эпитокных особей A. virens отлавливали в летний период в окрестностях Морской биологической станции СПбГУ на Белом море (Кандалакшский залив, губа Чупа). Лабораторную культуру зародышей получали с помощью искусственного оплодотворения по отработанной методике (Дондуа, 1975).

Культивирование зародышей и личинок A. virens проводили при +14°С. Время развития с момента оплодотворения приводится в часах после оплодотворения (чпо).

Размножающиеся P. dumerilii круглогодично содержались в морских аквариальных комнатах кафедры эмбриологии СПбГУ (линия дикого типа) и МФПЛ Университета Вены (инбредные линии PIN, VIO, FL2, трансгенные линии tuba::egfpvbci1 и r-opsin::egfpvbci2). Искусственное оплодотворение и культивирование зародышей проводили при +18°С по опубликованной методике (Hauenschild, Fischer, 1969).

Определение стадий развития A. virens и P. dumerilii проводили под микроскопом на живом материале по опубликованным описаниям хронологии эмбриогенеза (Костюченко, Дондуа, 2006; Kulakova et al., 2007; Fischer et al., 2010). В развитии A. virens различали и фиксировали следующие стадии: 2–4 бластомера (7 чпо), 8 бластомеров (8 чпо), 16 бластомеров (8 ч 40 мин), 17 бластомеров (9 ч 40 мин), 23 бластомера (10 ч 30 мин), формирование соматобласта 4d (12–13 чпо), переход к билатеральному дроблению (16 чпо), ранняя гаструла (18–20 чпо), поздняя гаструла/протрохофора (31–32 чпо), ранняя трохофора (43 чпо), средняя трохофора (59–62 чпо), ранняя метатрохофора (90 чпо), средняя метатрохофора (113 чпо). У P.

dumerilii анализировали стадии начала формирования второго квартета микромеров (3,5 чпо), формирование соматобласта 4d и четвертого квартета микромеров (5 чпо), переход к билатеральному дроблению и формирование М-клеток (5,5 чпо), ранняя гаструла (9 чпо), поздняя гаструла/протрохофора (16 чпо), ранняя трохофора (24 чпо), средняя трохофора (36 чпо), ранняя метатрохофора (48 чпо), нектохета (72 чпо и 96 чпо).



Pages:   || 2 | 3 |

Похожие работы:

«Министерство природных ресурсов и экологии Российской Федерации Федеральное агентство по недропользованию ФГУГП "Гидроспецгеология" Центр мониторинга состояния недр на предприятиях Госкорпорации "Росатом" Методические рекомендации по ведению объектного мониторинга состояния недр на предприятиях Госко...»

«ИСКУССТВЕННЫЕ ПЛЯЖИ ОСТРОВА НОРДЕРНЕЙ И МОНИТОРИНГ ИХ СОСТОЯНИЯ И.С. Подымов, Т.М. Подымова Южное отделение Института океанологии им. П.П. Ширшова РАН, г. Геленджик. podymov@coastdyn.ru, tpodymova@inbox.ru В современных условия...»

«вестник тюменского государственного университета. Экология и природопользование. 2016. том 2. № 1. 43-60 Ирина викторовна ФИЛИмоНова1 Леонтий викторович ЭдЕр2 алена ярославовна дяКуН3 тлеш муратович мамахатов4 Удк 553.041 КомпЛЕКСНый аНаЛИЗ СоврЕмЕННого СоСтояНИя НЕФтЕгаЗового КомпЛЕКСа воСточНо...»

«УДК 569.323: 591.24 (045) МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ТРАХЕОБРОНХИАЛЬНЫХ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ПАРОВ ФОРМАЛИНА А. И. Газизова1, Н.Б. Ахметжан...»

«© 1994 г. С.М. НАВАСАРДОВ ДЕМОГРАФИЧЕСКАЯ СИТУАЦИЯ И СОЦИАЛЬНЫЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ЭКОНОМИЧЕСКИХ РЕФОРМ В МАГАДАНСКОЙ ОБЛАСТИ НАВАСАРДОВ Сергей Михайлович — доктор медицинских наук, главный научный сотрудник Института биологических проблем Севера ДВО РАН. Тенденции воспрои...»

«The Nuclear Gin. Part II. La Via dell’ECOLOGIA. Ядерный Джин. Часть II.1. Курс на Экологию. Введение.1.1. Ядерный день рождения, 1896-2013 г.г., 117 лет аварий 1.2. АВАРИЯ В ФУКУCИМЕ 1.3. АВАРИЯ НА АТОМНОЙ СТАНЦИИ ТРИ-МАЙЛ-АЙЛЕНД В ПЕНСИЛЬВАНИИ, США 1.4. АТОМНАЯ АВАРИЯ В ЧЕРНОБЫЛЕ, УКРАИНА 1.5. АТОМНАЯ БОМБАРДИРОВКА...»

«МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ по сопоставлению данных разведки и разработки месторождений твердых полезных ископаемых Москва, 2007 Разработаны Федеральным государственным учреждением "Государственной комиссией по запасам полезных ископаемых" (ФГУ "ГКЗ") за...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Уральский государственный педагогический университе...»

«УДК 621.313.320 ПРОБЛЕМЫ, ПЕРСПЕКТИВЫ И ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ РАЗВИТИЯ ЭКОЛОГИЧЕСКИ ЧИСТЫХ ИСТОЧНИКОВ ЭЛЕКТРОЭНЕРГИИ В УКРАИНЕ Шевченко В. В., Лизан И. Я. Украинская инженерно – педагогическая академия, г. Харьков, г. Артемо...»

«Николай Фирсов Биологические науки. Словарь терминов. Микробиология "ДРОФА" Фирсов Н. Н. Биологические науки. Словарь терминов. Микробиология / Н. Н. Фирсов — "ДРОФА", 2006 ISBN 5-7107-9001-X Настоящая книга – вторая в серии словарей "Биологические науки".Словарь содержит более 1000 статей, объясняющих часто употребляемые те...»

«ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА Рабочая программа по обществознанию 8 класса составлена на основании документов: 1.Федеральный закон "Об образовании в Российской Федерации" от 29.12.201.2 №273 2.Приказы Министерства образования и науки Российской Ф...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "БЕЛГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" (НИУ "БелГУ) УТВЕРЖДАЮ Декан факультета горног...»

«ЕГЭ. Математика Содержание ЕГЭ. Математика ЕГЭ. Русский язык ЕГЭ. Обществознание. 8 ОГЭ. Русский язык ЕГЭ. История ЕГЭ. Литература ЕГЭ. Физика ЕГЭ. Информатика. 14 ОГЭ. Физика ЕГЭ. А...»

«ПОТАПОВ Дмитрий Викторович, САМОЙЛЕНКО Светлана Игоревна ВИДОВАЯ СТРУКТУРА СООБЩЕСТВ МЫШЕВИДНЫХ ГРЫЗУНОВ (НА ПРИМЕРЕ ГОМЕЛЬСКОГО РАЙОНА) В статье проанализированы видовой состав, особенности биотопического распределения и параметры биологического разнообразия сообществ мышевидных...»

«ЮРЦЕВА АНАСТАСИЯ ОЛЕГОВНА МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ АТЛАНТИЧЕСКОГО ЛОСОСЯ (SALMO SALAR L.) В ЕСТЕСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ И АКВАКУЛЬТУРЕ Специальность: 03.02.06 – ихтиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2011 Работа выполнена на кафедре ихтиологии и гидробиолог...»

«Биогазовые проекты в Украине. Финансируемые технологии. Киев, 24-25 марта 2011 Мазур Григорий Владиславович 61166 Украина г. Харьков ул. Новгородская 11, оф. 402 +38 057 752 30 74 +38 057 752 30 75 info@mnc.in.ua www.mnc.in.ua MNC certification MNC biogas MNC pure water MNC Kyoto Protocol MNC micro turbines Официальны...»

«РАБОЧАЯ ПРОГРАММА ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО МОДУЛЯ Проведение лабораторных микробиологических исследований (ПМ. О4) Архангельск 2013 г. Рабочая программа профессионального модуля "Проведения лабораторных микробиологических исследований" (ПМ.04) разработана на основе Федерального государственного...»

«коНфереНції, ювілеї УДК 636.4:061.31(091) герасимов в.и., профессор Харьковская государственная зооветеринарная академия сагло а.ф., кандидат биологических наук Институт свиноводства и агропромышленного производства НААН к истории проведеНия междуНародНЫх НаучНопроизводствеННЫх коНфереНций по свиНов...»

«Научно-исследовательская работа Тема работы: "Паук как домашний питомец"Выполнил: Габбасов Тамерлан Серикович учащийся _8 класса МБОУ "Георгиевской СОШ "Руководитель: Кузина Сабина Станиславовна учитель биологии МБОУ "Георгиевской СОШ " Содержание работы Введение I. Теоритическая часть 1.Общая хара...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФГБОУ ВО "СГУ имени Н.Г. Чернышевского" Биологический факультет Рабочая программа дисциплины Биология индивидуального развития Направление подготовки 44.03.01 Педагогическое образование Профиль подготовки Биология Квалификация выпускника Бакалавр Форма обучения очна...»

«Национальное оценивание образовательных достижений учащихся (НООДУ) Кыргызской Республики в 2009 году Приложение 11 Примеры заданий НООДУ 1. Математика. 4 класс 2. Родиноведение. 4 класс 3. Чтение и понимание. 4 класс 4. Математика. 8 класс 5. Физика...»

«270 ЕКОНОМІКА ПРИРОДОКОРИСТУВАННЯ ТА ОХОРОНИ НАВКОЛИШНЬОГО СЕРЕДОВИЩА Светлана В. Шарыбар ФОРМИРОВАНИЕ РАЦИОНАЛЬНОЙ СОЦИАЛЬНО-ЭКОЛОГОЭКОНОМИЧЕСКОЙ ИНВЕСТИЦИОННОЙ ПОЛИТИКИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ В статье показано, что формирование рациональной социально-экол...»

«УДК 639.371.5 ДИНАМИКА РЫБОВОДНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ШЕСТИ ПОКОЛЕНИЙ БЕЛОВСКОГО КАРПА КАК РЕЗУЛЬТАТ СТУПЕНЧАТОГО ОТБОРА ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ Законнова Л.И., Ростовцев А.А. Филиал КузГТУ в г. Белово Белово, Россия (652644, Кемеровская обл., г. Белово, пгт. Инской, ул. Ильича, 32-а), nir_belovo@mail.ru Методическ...»










 
2017 www.book.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.