WWW.BOOK.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные ресурсы
 
s

«МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 1999, том 33, № 4, с. 611-619 ФИЗИКА И ФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ БИОПОЛИМЕРОВ УДК 577.323 ВЛИЯНИЕ ЛОКАЛЬНОЙ КОНФОРМАЦИИ ДНК НА СВЯЗЫВАНИЕ бис-НЕТРОПСИНОВ В МАЛОЙ БОРОЗДКЕ ...»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 1999, том 33, № 4, с. 611-619

ФИЗИКА И ФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ БИОПОЛИМЕРОВ

УДК 577.323

ВЛИЯНИЕ ЛОКАЛЬНОЙ КОНФОРМАЦИИ ДНК

НА СВЯЗЫВАНИЕ бис-НЕТРОПСИНОВ В МАЛОЙ БОРОЗДКЕ ДНК

© 1999 г. А. Н. Суровая1, С. Л. Гроховский2, В. Ф. Письменский1,

Г. Буркхардт3, К. Циммер3, Г. В.Гурский1

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва 117984 Университет Осло, Центр медицинских исследований, Осло, Норвегия.

Институт молекулярной биологии Университета им. Фридриха Шиллера, Иена, Германия Поступила в редакцию 27.05.98 г.

Методом КД и УФ-спектроскопии, а также флуоресцентными методами исследовано взаимодейст­ вие с олигонуклеотидными дуплексами двух бис-нетропсинов, содержащих в качестве короткого линкера cis-диаминоплатину (II) - (—Nt-Pt(NH 3 ) 2 -Nt—) или гибкую цепочку, состоящую из пяти метиленовых звеньев (—Nt-(CH2)5-Nt—). В обоих лигандах нетропсиновые фрагменты были присоединены в одинаковой ориентации (хвост к хвосту). Показано, что —Nt-Pt(NH3)2-Nt— об­ ладает наибольшим сродством к последовательности 5'-ТТTTАААА-3'. Расположение блока А4 на 5'-конце уменьшает сродство —Nt-Pt(NH3)2-Nt— к ДНК. Эффект, вероятно, связан со способ­ ностью блока 5'-Т4А4-3' изгибаться в сторону широкой бороздки, расширяя при этом малую, что выгод­ но для связывания —Nt-Pt(NH3)2-Nt—. бис-Нетропсин, —Nt-(CH2)5-Nt—, имеющий гибкий линкер, при той же ориентации нетропсиновых фрагментов, что и —Nt-Pt(NH3)2-Nt—, имеет оди­ наковое сродство к ДНК независимо от расположения блоков Т4 и А4 относительно 5'-конца дуплекса.

Дифференциальные спектры КД, вычисленные для комплексов —Nt-Pt(NH3)2-Nt— с олиго­ нуклеотидными дуплексами, имеющими расширенную малую бороздку, приобретают характер­ ную форму с двумя длинноволновыми максимумами. Этот факт свидетельствует о связывании —Nt-Pt(NH3)2-Nt— в конформации шпильки, в которой нетропсиновые фрагменты образуют па­ раллельный двутяжевый мотив. Показано, что для специфического связывания —Nt-Pt(NH3)2-Nt— важна как определенная нуклеотидная последовательность, так и локальная конформация малого желоба ДНК.

Ключевые слова: бис-нетропсины, платина, специфическое узнавание в малой бороздке ДНК, КД-спектроскопия.

Конструирование и синтез ДНК-связывающих тропсиновые фрагменты были ковалентно связа­ лигандов, способных узнавать заданную последо­ ны в различной ориентации с помощью коротких вательность и избирательно воздействовать на линкеров. В качестве линкеров использовались экспрессию генов, представляет несомненнный гибкие метиленовые цепочки разной длины [8], интерес. Известно, что антивирусные и противо­ короткий антипараллельный пептидный мотив опухолевые антибиотики нетропсин и дистамицин [9], а также остаток cis-диаминоплатины(II) [10].

специфически взаимодействуют с АТ-парами в ма­ Было показано, что бис-нетропсин, содержащий лой бороздке ДНК [1]. Из рентгеноструктурного остаток платины, специфически связывается с анализа [2-4] и исследований методом ЯМР-спект- определенными нуклеотидными последователь­ роскопии [5] известно, что карбоксамидные ностями, и под действием рентгеновских лучей NH-группы образуют цепочку водородных свя­ наблюдается щепление двух нитей ДНК в строго зей с N3 аденинов и O2 пиримидинов (тимины и определенном месте. Методом футпринтинга, а цитозины) в соответствии с молекулярными мо­ также по щеплению ДНК было показано, что не делями, предложенными для этих комплексов ра­ все АТ-богатые последовательности ДНК равно­ нее [6,7].





Образованию водородных связей между значны для сильного связывания лиганда. Лиганд карбоксамидными группами и N3-атомами гуани­ обладал преимущественным сродством к псевдосим­ нов стерически препятствует NH2-rpynna гуани­ метричной последовательности 5'-ТTTТАААА-3' нов, выступающая в малый желоб ДНК.

В предыдущей нашей работе было показано, что —Nt-Pt(NH3)2-Nt— образует два типа ком­ В предыдущих наших работах для увеличения плекса при связывании с поли[d(АТ)•полиd(AT)] и и изменения специфичности связывания была син­ олигомерными дуплексами с последовательностью тезирована серия бис-нетропсинов, в которой неСУРОВАЯ и др.

5'-СС(ТА)nСС-3' где n = 4, 5 и 6 [11]. Первый тип мии. Использовали следующие олигонуклеотиды:

комплекса соответствует связыванию 5'-CGTTTTAAAACG-3' (1), 5'-CGAAAATTTTCG-3' (2), —Nt-Pt(NH3)2-Nt— в растянутой конформа- 5'-CGTTTTCAAACG-3' (3), 3'-CGTTTCCAAACG-3' (a), ции со стехиометрией 1 молекула лиганда на ви­ 3'-GCAAAGGTTTGC-5' (b), 5'-CGAAACCTTTCG-3' (c), ток спирали ДНК. Второй тип комплекса соот­ 3 ' - G C T T T G G A A A G C - 5 ' (d), 3'-GCAAAIITTTGC-3' (e), ветствует связыванию —Nt-Pt(NH3)2-Nt— в 3 ' - G C T T T I I A A A G C - 5 ' (f), 5-CCTTTTCIAAAACCформе шпильки, формирующейся на основе па­ -3' (i), 3 ' - G G A A A A I C T T T T G G - 5 ' (k).

раллельного пептидного мотива, который встраи­ Молярные концентрации олигонуклеотидов вается в малый желоб ДНК. определяли путем измерения оптической плотно­ В настоящей работе предпринята попытка сти олигонуклеотидов при 90°С при 260 нм, ис­ объяснить природу преимущественного связыва­ пользуя коэффициенты молярной экстинкции ния —Nt-Pt(NH3)2-Nt— с определенной АТ-по- при 260 нм, равные 112200 для олигонуклеотидов следовательностью физико-химическими мето­ 1 и 2, 119600 - для 3, 127000 - для олигонуклеотидов дами. Для этой цели были синтезированы корот­ а и с, 135800 для олигонуклеотидов b, d, е и f, кие олигонуклеотиды, с различной ориентацией 147200 - для i, 164800 - для к. Для образования Т- и А-блоков относительно 5'-конца, а также с дуплексов, содержащих олигонуклеотиды а + b (IV), различными заменами АТ-пар в центре олиго- с + d(V),a + e (VI), с + f (VII), и i + k (VIII), компле­ нуклеотидов на GC, IС, CI и II нуклеотидные па­ ментарные нити смешивали в эквимолярных ко­ ры. Методом КД и УФ-спектроскопии, а также личествах, отжигали при 90°С и затем медленно флуоресцентными методами было Исследовано охлаждали до комнатной температуры в течение взаимодействие с этими олигонуклеотидными 8-10 час. Кривые плавления, полученные для дуплексами двух бис-нетропсинов, содержащих в дуплексов, имели только один переход из двуспикачестве короткого линкера остаток cis-диами- рального в расплавленное состояние. Использо­ ноплатины (П) (—Nt-Pt(NH3)2-Nt—) и гибкую ванные нами олигонуклеотиды содержали палинцепочку, состоящую из пяти метиленовых звень­ дромные последовательности и, в принципе, мог­ ев (—Nt-(CH2)5-Nt—). Химические формулы ли образовывать как дуплекс, так и шпильку. Мы бис-нетропсинов представлены на рис. 1. В обоих различали дуплекс и однонитевую шпильку с по­ лигандах мономерные фрагменты были присое­ мощью метода Поляризованной флуоресцении.

динены в одинаковой ориентации (хвост к хвос­ Измеряли поляризованную флуоресценцию этиту). Показано, что —Nt-Pt(NH3)2-Nt— предпо­ дия бромида, адсорбированного на олигонуклеочитает последовательность, в которой блок Т4 тидах при очень малых заполнениях лигандом расположен с 5'-конца. Наличие в центре 3'-ТА- ДНК (не более 1 молекулы этидия бромида на 3'-динуклеотида, который может локально изги­ олигонуклеотид). Из измерений зависимости по­ баться в сторону широкого желоба, расширяя та­ ляризации флуоресценции от температуры или ким образом узкий, по-видимому предпочтительно вязкости растворителя рассчитывали время вра­ для —Nt-Pt(NH3)2-Nt—, имеющего жесткий щательной релаксации, которое при жесткой по­ массивный линкер, которому легче встроиться в садке лиганда на дуплексе пропорционально гид­ расширенный малый желоб. Для лиганда с линке­ родинамическому объему и форме дуплекса. По­ ром в виде гибкой метиленовой цепочки ориента­ скольку гидродинамический объем дуплекса и ция блоков Т4 и А4 относительно 5'-конца дуплекса шпильки отличаются почти в два раза, то данный не имеет существенного значения. Исследование метод позволял легко отличить дуплекс от взаимодействия лигандов с олигонуклеотидными шпильки. Мы работали только с дуплексами. Ис­ дуплексами, имеющими различные замещения следовали взаимодействие —Nt-Pt(NH3)2-Nt— АТ-пар в центре дуплекса, показали, что для специ­ и —Nt-(CH2)5-Nt— со следующими олигонук­ фического взаимодействия важна как нуклеотид- леотидными дуплексами:

ная последовательность, так и локальная кон- 5'-CGTTTTAAAACG-3' 5'-CGAAAATTTTCG-3' формация малого желоба ДНК. 3'-GCAAAATTTTGC-5' (I) 3'-GCTTTTAAAAGC-5' (II)

–  –  –

Рис 1. Структуры нетропсина (а), бис-нетропсина с линкером в виде остатка cis-диаминоплатины (—Nt-Pt(NH3)2Nt—) (б), и бис-нетропсина с линкером из пяти метиленовых звеньев (—Nt-(CH2)5-Nt—) (в). Каждый бис-нетропсин содержит два нетропсиноподобных фрагмента, которые N-концами ковалентно сшиты посредством корот­ ких линкеров в ориентации хвост к хвосту.

–  –  –

Рис. 2. Спектры кругового дихроизма (КД) для комплексов —Nt-Pt(NH3)2-Nt— с олигонуклеотидными дуплекса¬ ми I (5'-CGTTTTAAAACG-3') (а) и П (5'-CGAAAATTTTCG-3') (Ь). Концентрации дуплексов I и П равны 28 mkМ и 17.5 mkМ соответственно. ^D/O - амплитуда КД, рассчитанная на моль дуплекса и 1 см оптического пути. Величины С/О (отно¬ шение концентрации лиганда к концентрации дуплекса) равны: панель а) - 0 (0), 1 (0.09), 2 (0.27), 3 (0.55), 4 (0.91), 5 (1.91); панель б) - 0 (0), 1 (0.16), 2 (0.41), 3 (0.55), 4 (0.82), 5 (1.63). Условия: 0.001 М Na-какодилатный буфер (рН 7.0) в присутствии 0.1 М NaCl, при 20°С.

–  –  –

Рис 3. Титрование —Nt-Pt(NH3)2-Nt— при 310 нм олигонуклеотидных дуплексов (1) - I (28 mkМ) и (2) - II (17.5 mkМ) (а).

Условия, как на рис. 2. ^D/O - амплитуда КД, рассчитанная на моль дуплекса и 1 см оптического пути. С/О-отношение концентрации лиганда к концентрации дуплекса (б). Устойчивость комплексов —Nt-Pt(NH3)2-Nt— с дуплекса¬ ми I (7) и П (2) как функция концентрации NaCl. ^е0 - молярный дихроизм при 0.1 М NaCl.

Рис. 4. Титрование —Nt-(CH2)5-Nt— при 310 нм олигонуклеотидных дуплексов (1) -1 (14 цМ) и (2) - П (14 цМ) (а).

AD/O - амплитуда КД, рассчитанная на моль дуплекса и 1 см оптического пути. С/О - отношение концентрации лиган¬ да к концентрации дуплекса. Условия, как в рис. 2. Устойчивость комплексов —Nt-(CH2)5-Nt— с дуплексами I (/) и II (2), как функция концентрации NaCl (б). ^E0 - молярный дихроизм при 0.1М NaCl.

–  –  –

только один пиримидин-пуриновый контакт, а в дуплексе III - два таких контакта, т.е. в дуплексе Ш малый желоб сильнее расширен и возможно встра¬ ивание двутяжевого мотива. Насыщающие уровни кривых титрования для комплексов —Nt-Pt(NH3)2-Nt— с дуплексами IV и V (две гомо GC-пары вместо ТА) равны 25-27, что составляет примерно половину от амплитуды КД, когда свя¬ заны оба фрагмента. Такое низкое значение амп¬ литуды КД при насыщении дуплекса лигандом также можно объяснить связыванием только од¬ ного нетропсинового фрагмента или связывани¬ ем лиганда в форме шпильки, что должно приво¬ дить к изменению формы спектра КД.

Анализ дифференциальных спектров КД для комплексов —Nt-Pt(NH3)2-Nt— с изученными олигонуклеотидными дуплексами На рис. 5б приведены дифференциальные спе¬ ктры КД для комплексов —Nt-Pt(NH3)2-Nt— с дуплексами VI и VIII, с которыми лиганд связыва¬ ется обоими нетропсиновыми фрагментами, и с дуплексами III, IV, и V, при связывании с которы¬ ми насыщающий уровень кривых титрования со¬ ответствует связыванию только одного фрагмен¬ та. Дифференциальные спектры получены вычи¬ танием из спектров комплексов спектров соответствующих олигонуклеотидных дуплек¬ сов. Сравнивая дифференциальные спектры КД, полученные для комплексов —Nt-Pt(NH3)2-Nt— с дуплексами, когда связываются оба нетропсиновых фрагмента и только один, можно заметить, что в случае дуплексов III, IV и V, не только уменьшается амплитуда КД, но сильно меняется и форма спектров. Спектры уширяются и появляются два длинноволновых максимума.

Как показано в предыдущей нашей работе [11], наличие двух длинноволновых максимумов сви¬ Рис. 6. Разностные спектры КД, характерные для свя¬ детельствует о связывании —Nt-Pt(NH3)2-Nt— зывания —Nt-Pt(NH3)2-Nt— (/) в растянутой кон¬ в форме шпильки, с параллельной ориентацией не- формации и (2) в форме шпильки (о); сравнение экспе¬ риментальных и теоретически рассчитанных (пунктир) тропсиновых фрагментов.

спектров КД для комплексов —Nt-Pt(NH3)2-Nt— Дифференциальные спектры КД для комплек¬ с дуплексами IV (б) и V (в). AD и AD0 - амплитуды КД, сов —Nt-Pt(NH3)2-Nt— с дуплексами Ш, IV и V рассчитанные на 1 см оптического пути в присутствии могут быть достаточно хорошо представлены в ви¬ и в отсутствие лиганда.

де линейной комбинации двух реперных КД спект¬ ров: дифференциальных спектров КД, соответству¬ ющих связыванию —Nt-Pt(NH3)2-Nt— в растя¬ составляет 45% и растянутой 55%. При связыва¬ нутой конформации и в конформации шпильки.

нии —Nt-Pt(NH3)2-Nt— с дуплексом Ш 38% и Эти реперные спектры были рассчитаны в на¬ 62% лиганда находятся в шпилечной и растяну¬ шей работе [15] и приведены на рис. 6а. На рис. 6а и 6в дифференциальные спектры КД для ком¬ той конформации соответственно (данные не плексов —Nt-Pt(NH3)2-Nt— с дуплексами IV приводятся). По-видимому, включение в цент¬ и V представлены в виде линейной комбинации ральную часть дуплексов двух GC-пap, или ICдвух реперных спектров, рассчитанной для рав¬ пары, содержащей подряд два пиримидин-пуриновесной смеси, содержащей 58% лиганда, свя¬ новых контакта, расширяет малый желоб, поз¬ занного в конформации шпильки и 42% - в рас¬ воляя вклиниться и двутяжевому димерному мо¬ тянутой конформации для дуплекса IV, для дуп¬ лекса V содержание шпилечной конформации тиву.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ том 33 №4 1999 СУРОВАЯ и др.

Рис. 7. Устойчивость комплексов —Nt-Pt(NH3)2-Nt— с дуплексами I-VHI, как функция концентрации NaCl. a дуплексы I - (7), III - (2), VI - (3) и IV - (4), (блок Т4 расположен с 5'-конца); 6 - дуплексы П - (7), VII - (2) и V - (5), (блок А4 расположен с 5'-конца). ^e0 - молярный дихроизм при 0.1 М NaCl.

–  –  –




Похожие работы:

«ПОЛОЖЕНИЕ О ПРИМЕНЕНИИ МЕТОДОВ МАТЕМАТИЧЕСКОЙ СТАТИСТИКИ ДЛЯ УЧЕТА И КОНТРОЛЯ ЯДЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ РБ 066 11 проведение сертификации ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ЭКОЛОГИЧЕСКОМУ, ТЕХНОЛОГИЧЕСКОМУ И АТОМНОМУ НАДЗОРУ УТВЕРЖДЕНО приказом Федеральной службы по экологическому, технологическому и атомному надзо...»

«ВЕСТНИК ОРЕНБУРГСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ПЕДАГОГИЧЕСКОГО УНИВЕРСИТЕТА Электронный научный журнал (Online). ISSN 2303-9922. http://www.vestospu.ru УДК 581.527.2:581.9 (235.21) В. И. Авдеев Молекулярно-биологические аспекты ареаловедения видов злаков подтрибы пшеницевых На основе...»

«Дидактические игры по познавательному развитию (экологическое воспитание) для детей старшей группы компенсирующей направленности Игра ведущий вид деятельности в дошкольном возрасте. Дидактическая игра – явление многоплановое, сложное. Это и метод обучения, и форма обучен...»

«Биогазовые проекты в Украине. Финансируемые технологии. Киев, 24-25 марта 2011 Мазур Григорий Владиславович 61166 Украина г. Харьков ул. Новгородская 11, оф. 402 +38 057 752 30 74 +38 057 752 30 75 info@mnc.in.ua www.mnc.in.ua MNC certification MNC biogas MNC pure wa...»

«МЕЛЬНИКОВ ДЕНИС ГЕРМАНОВИЧ СИСТЕМАТИКА И ГЕОГРАФИЯ РОДА CLINOPODIUM L. (LAMIACEAE) ЕВРАЗИИ "Ботаника" 03.02.01 Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук профессор А. Л. Буданцев Санкт-Петербург Оглавление Введение Глава 1. Обзор литературы 1. 1. Род Clinopodium в работах долинне...»

«УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации Г.Г.ОНИЩЕНКО 28 июля 2008 г.Дата введения: с 1 сентября 2008 года 4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАК...»

«3 Защита органов дыхания от спор сибирской язвы Часто задаваемые вопросы В последнее время в 3М поступает много запросов от сотрудников и производственных рабочих о рекомендуемых средствах защиты органов дыхания при потенциально возможных контактах с биологическими ф...»

«ЛЕОНОВ Вячеслав Сергеевич Разработка технологии производства субстанций терапевтических вакцин против заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека 6/11 и 16/18 типов 03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)...»

«ЗАКОН РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН О ГЕОГРАФИЧЕСКИХ УКАЗАНИЯХ (в редакции Закона РТ от 03.07.2012г.№855) Настоящим Законом регулируются отношения, возникающие в связи с правовой охраной и использованием географических указаний происхождения товара в Республике Таджи...»










 
2017 www.book.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.