WWW.BOOK.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные ресурсы
 
s

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

«Трансгенные эукариотические организмы курс лекций Минск БГУ Александр Георгиевич Песнякевич, кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии. Курс лекций разработан для биологического ...»

-- [ Страница 3 ] --

Отличие таких молекул заключается в том, что в их состав вводятся последовательности какого-либо известного хромосомного гена либо как единый фрагмент, либо в виде двух фрагментов, окаймляющих предназначенную для введения в геном последовательность. В качестве примеров таких векторов наиболее часто упоминают конструкции, разработанные для другого вида дрожжей – Pichia pastoris.

Дело в том, что широкое применение Saccharomyces cerevisiae в практической биотехнологии показало наличие некоторых проблем как в культивировании трансгенных дрожжей этого вида, так и довольно высокую стоимость получаемых на их основе препаратов. Поэтому уже давно в поле зрения «грибных» генных инженеров находятся другие виды – Schizosaccharomyces pombe (интересны тем, что не почкуются, а делятся, а это имеет значение при промышленном культивировании), Kluyveromyces lactis и способные утилизировать относительно дешевые субстраты в качестве источников углерода и энергии Yarrowia lipolytica (растет на алканах), Hansenula polymorpha и Pichia pastoris (метанолутилизирующие дрожжи). Существенно также и то, что эти виды дрожжей отличаются от Saccharomyces cerevisiae и друг от друга системами посттрансляционной модификации белков и системами их секреции. Это позволило подобрать оптимальные условия для получения некоторых белков животных и человека, продукция которых оказывалось не оптимальной в стандартных штаммах пекарских дрожжей.

Один из вариантов интегрирующих векторов для работы с Pichia pastoris изображен на рис. 26.

Рис. 26. Вектор для интеграции и интеграция гена в хромосому Pichia pastoris.

В качестве обеспечивающих рекомбинационное встраивание последовательностей вектор содержит начало и конец гена алкогольоксидазы 1 (у дрожжей этого вида образуются две алкогольоксидазы – 1 и 2, первая из них является основной, вторая – вспомогательной, но в норме их совместное действие и позволяет клеткам активно использовать метанол для питания. Замена одного из генов на вставку в целом несколько снижает скорость роста на метаноле, но это снижение не сильно сказывается на промышленном культивировании таких штаммов. Важно, что оба эти гена экспрессируются наиболее активно именно в присутствии метанола, как индуктора, т.е.

имеют так называемые метанолиндуцируемые промоторы). Первый фрагмент гена алкогольоксидазы 1 (5-фрагмент) одновременно является и промотором для вводимого в геном дрожжей гена (в данном случае ген поверхностного антигена вируса гепатита В – HbSAg). Сайт терминации транскрипции и полиаденилирования также обычно используют из гена алкогольоксидазы, но за ним обычно располагают дрожжевой ген, кодирующий один из белков пути биосинтеза аминокислоты или азотистого основания (в данном варианте – ген his4). Наличие этого гена в интегрируемом участке плазмиды позволяет отобрать после трансформации дефектного по синтезу этого фактора роста штамма дрожжей те клетки, в которых интеграция прошла вследствие двойного кроссинговера по 5-фрагменту и расположенному за геном фактора роста 3-фрагменту гена алкогольоксидазы 1.

В ряде случаев стабильно интегрированные инсерции в хромосомы дрожжей удавалось получить даже без дополнительных фрагментов выбранного для интеграции гена, поскольку осуществлялась интеграция за счет промоторного участка, под который ставился вводимый ген, и расположенного сразу же за ним сайта терминации/полиаденилирования. Примером такой интеграции может служить введение генов - и -цепей человеческого гемоглобина в хромосому Hansenula polymorpha (конструкция MOXp-Hb-Hb-MOXt, промоторная и концевая последовательности взяты из гена метанолоксидазы дрожжей этого вида).





Еще одним примером интегрирующего вектора может служить конструкция, использованная для введения гена бычьего лизоцима в геном Pichia pastoris (желудочный фермент жвачных, используется как добавка к комбикормам). В данном случае интеграция была осуществлена не по последовательностям гена алкогольоксидазы, а по последовательностям гена his4 дрожжей. Использовался все тот же дефектный по синтезу гистидина штамм-реципиент, но был отобран вариант, когда кроссинговер произошел между двумя последовательностями гена his4 – дефектной и нормальной, внесенной в результате интеграции. В этом случае интегрируется вся плазмида и достаточно одиночного кроссинговера, чтобы осуществилась такая встройка (рис. 27).

Еще один стабильный вариант наследования чужеродной генетической информации получил название «искусственная дрожжевая хромосома» (YAC). Этот вариант векторных молекул разработан для Saccharomyces cerevisiae и используется для вставок больших фрагментов (более 100 т.п.н.) ДНК. Для получения промышленных штаммов дрожжей такие варианты не находят широкого применения, но зато широко применяются для физического картирования ДНК высших эукариот, включая человека.

Рис. 27. Интеграция целевого гена в хромосому дрожжей за счет одиночного кроссинговера.

Целевой ген бычьего лизоцима обозначен буквой L.

Рис. 28. Искусственная хромосома дрожжей (YAC – yast artificial chromosome).

В упрощенном виде плазмида для получения искусственных дрожжевых хромосом (pYAC) представляет собой (рис.

28):

1) фрагмент pBR322 (Ampr, oriE);

2) последовательность, обеспечивающую автономную репликацию линейных молекул в клетках дрожжей (ARS);

3) последовательность, соответствующую центромерной области дрожжевой хромосомы (CEN);

4) гены биосинтеза аминокислот и азотистых оснований в дрожжевых клетках (TRP1 и URA3);

5) две теломерные области дрожжевой хромосомы (Т);

6) находящийся между последовательностями центромеры и теломером уникальный сайт рестрикции (например, для SmaI);

7) два тоже уникальных (т.е. нигде более в этой плазмиде не встречающихся) сайта рестрикции для другой рестриктазы, располагающиеся по обращенным друг к другу концам теломерных областей (BamHI-сайты).

ДНК такой плазмиды, выделенная из E. coli, подвергается обработке двумя рестриктазами, специфичными к двум выше указанным уникальным сайтам, и щелочной фосфатазой (последнее необходимо, чтобы не образовывались вновь кольцевые молекулы

– щелочная фосфатаза отщепляет фосфатные группы с 5-концов, а без них ДНК-лигаза не соединяет молекулы). ДНК организма, последовательности которого хотят клонировать в дрожжах, обрабатывают рестриктазой, для которой в pYAC имелся только один уникальный сайт, и смешивают с фрагментами плазмиды. В результате лигирования получаются линейные молекулы с теломерными последовательностями по концам, которые после введения в клетки дрожжей, дефектных по тем генам синтеза аминокислот и оснований, которые имеются в плазмиде, поддерживаются как автономные хромосомы.

Отбор обеспечивается появлением у трансформированных клеток прототрофности, а для подтверждения наличия вставки часто используют какой-либо маркерный ген, продукт которого дает цветную реакцию. В этом случае такой ген располагается так, чтобы вставка по уникальному сайту нарушала его рамку считывания, и на специальной среде отбираются неокрашенные колонии.

При конструировании штаммов дрожжей для промышленного получения какоголибо белка других организмов, как правило, стараются добиться секреции этого белка в культуральную жидкость. Это важно не только для очистки получаемого препарата, но и потому, что в клетках дрожжей гликозилированию и ряду других посттрансляционных изменений подвергаются только секретируемые белки, т.е. если белок проявляет свою активность только в гликозилированой форме, то его обязательно нужно сделать секретируемым. На современном этапе решение этой проблемы не представляет особого труда, поскольку клонированы последовательности ряда секретируемых дрожжевых белков и определены те их участки которые обеспечивают секрецию (так называемые лидерные последовательности). Наиболее часто используется пре-про--фактор – лидерная (сигнальная) последовательность белка 1, одного из белков, обеспечивающих спаривание дрожжей при половом размножении (фактор спаривания).

Последовательность чужеродного белка (кДНК, полученную на матрицах информационнной РНК нужного гена) объединяют с пре-про--фактором и затем такую конструкцию ставят под какой-либо дрожжевой промотор (в таких векторах полилинкер располагается после пре-про--фактора, уже стоящего под промотором). Существенно также и то, что лидерная последовательность в процессе секреции отрезается эндопептидазой, действующей на конкретное сочетание аминокислотных остатков –LysArg, поэтому необходимо чтобы кодирующие эти две аминокислоты кодоны находились непосредственно перед началом собственно структурной последовательности чужеродного белка.

На эффективность секреции белков дрожжевыми клетками оказывают также влияние и такие ферменты, как дисульфидизомеразы, от которых зависит создание правильной третичной структуры секретируемого белка. Установлено, что уровень секреции гетерологичных белков можно повысить путем увеличения количества молекул таких ферментов: когда собственный дисульфидизомеразный ген Saccharоmyces cerevisiae поставили под более мощный и, главное, конститутивно действующий промотор гена дрожжевой глицеральдегидфосфатизомеразы, уровень продукции фермента повысился в 16 раз, а количество секретируемого чужеродного для дрожжей фактора роста тромбоцитов В человека повысилось в 10 раз. Но сверхпродукция дисульфидизомеразы повышает уровень секреции только тех белков, которые имеют большое количество дисульфидных связей в третичной структуре, поэтому применить этот уже полученный штамм-сверхпродуцент для улучшения секреции многих других белков не удается.

Однако сам принцип, заключающийся в повышении количества белков, осуществляющих в ходе секреции посттрансляционные модификации секретируемых молекул, имеет дальнейшее развитие, и проводятся направленные исследования по установлению тех белков дрожжей, которые вносят определенные изменения (фосфорилирование, сульфатирование, карбоксилирование, ацилирование, ацетилирование, миристилирование и пальмитоилирование, N- и О-гликозилирование).

Таким образом, высокая степень изученности физиологии и в особенности генетической организации дрожжей, создание на этой основе эффективных систем введения и экспрессии генетической информации других эукариотических организмов обусловило наиболее широкое практическое применение именно дрожжевых трансгенных организмов. Кроме того, вещества, получаемые с помощью трансгенных дрожжей, не рассматриваются как потенциально опасные с точки зрения генетической безопасности, поскольку вид Saccharomyces cerevisiae обозначен соответствующими органами контроля США и ряда других стран как GRAS – generally recognized as safe, а это значит, что нет необходимости получать специальное разрешение на выпуск и распространение получаемых продуктов.

На начало 21-го века с помощью дрожжей производили используемые в качестве медицинских препаратов эпидермальный фактор роста человека, человеческий инсулин, проинсулин, инсулиноподобный фактор роста, тромбоцитарный фактор роста, фактор роста фибробластов, гранулоцит-моноцит колонийстимулирующий фактор, 1антитрипсин, фактор XIIIa из системы свертывания крови, а в качестве вакцинных препаратов и веществ, используемых в медицинских диагностических наборах, – поверхностный антиген вируса гепатита В, белок малярийного плазмодия, белок оболочки ВИЧ-1, белок вируса гепатита С, антигены ВИЧ-1.

Список штаммов трансгенных дрожжей для промышленного получения белков различного назначения постоянно пополняется. Но уже сейчас стало понятно, что дрожжи не являются универсальными экспрессирующими любую генетическую информацию организмами, поэтому разрабатываются и испытываются методы использования клеток многоклеточных эукариот для подобных целей, а именно клеток насекомых и млекопитающих.

Культуры клеток насекомых как объект генетической инженерии Выбор клеток именно этих представителей царства Животных для генноинженерных манипуляций базируется на довольно хорошо отработанных методах поддержания их в культуре, а также на изученности ДНК-содержащих вирусов этих организмов –бакуловирусов. Именно эти вирусы уже нашли применение в качестве объектов, используемых для биологического контроля за численностью насекомыхвредителей в лесном и сельском хозяйстве.

Механизм их репродукции в организмах членистоногих достаточно хорошо исследован и заключается в следующем. После попадания вириона бакуловирусов в клетку эпителия кишечника насекомого он проникает в ядро, где и происходит раздевание, т.е. освобождение двунитевой ковалентно замкнутой кольцевой ДНК вируса из белкового капсида. В ядре происходит репликация этой ДНК, затем экспрессия генов, кодирующих белки собственно вирионов, и образование новых вирусных частиц.

Некоторая часть вновь образовавшихся вирионов отшнуровывается от клеток и гемолимфой насекомого разносится по организму животного, но большая часть собирается в компактную структуру внутри клетки и покрывается специальной оболочкой, состоящей в основном из белка полиэдрина, т.е. переходит в неактивное состояние. За счет активных вирусов, распространяющихся по организму, постепенно происходит накопление таких полиэдриновых частиц во многих клетках организма насекомого, и через 5-6 дней после заражения насекомое погибает. Считается, что за это время происходит 10 раундов репликации вирусных частиц в каждой инфицированной клетке, и в теле мертвого насекомого доля содержащих множество вирионов полиэдриновых частиц достигает 25% от сухой массы. Такие полиэдриновые комплексы могут длительное время сохраняться в окружающей среде пока не будут съедены следующим насекомым. В кишечнике насекомого полиэдриновый матрикс распадается под действием протеаз, и освободившиеся вирионы поражают клетки кишечника.

ДНК бакуловирусов в последней четверти 20-го века была расклонирована в системе E. coli и определена функция основных генов. Это позволило разработать на основе ДНК этих вирусов векторные системы для генно-инженерных манипуляций с клетками беспозвоночных.

Было установлено, что цикл развития вируса не нарушается, если из генома удалить структурный ген полиэдрина, т.е. репродукция вирусных ДНК продолжается в обычном порядке, хотя полиэдронов (содержащих вирионы кристалов из полиэдрина) не образуется. Кроме того, оказалось, что промотор гена полиэдрина является очень сильным и работающим конститутивно. Это и послужило основой для применения бакуловирусов в качестве векторных систем.

Основным видом вируса, на котором проводятся все исследования генноинженерного направления, является вирус множественного ядерного полиэдроза Autographa californica (AcMNPV). В природе он поражает более 30 видов насекомых и, что более важно, хорошо репродуцируется в культурах клеток. В основном с этим вирусом работают на культуре клеток травяной совки Spodoptera frugiperda, в которых промотор гена полиэдрина наиболее активен.

Векторы для введения генетической информации в клетки насекомых представляют собой стандартную плазмиду E. coli на основе pBR322 (т.е.

гены Ampr и oriV, экспрессирующиеся в клетках прокариот), в которую встроены фрагменты ДНК AcMNPV:

1) последовательность, предшествующая 5-концу гена полиэдрина и имеющая достаточную для рекомбинации протяженность;

2) промоторная область этого же гена, обозначаемая Рр;

3) сайт терминации транскрипции и полиаденилирования гена полиэдрина (Pt) и следующая за ним последовательность ДНК вируса, являющаяся в плазмиде вторым сайтом рекомбинации с ДНК AcMNPV. Между фрагментами Рр и Pt находится один из стандартных искусственных полилинкеров.

Последовательность нужного гена вводится в вектор в системе E. coli и здесь же нарабатывается ДНК для трансфекции (по отношению к клеткам животных введение любой ДНК называют трансфекцией, поскольку термин трансформация традиционно используется для обозначения злокачественных изменений). Трансфекции подвергаются клетки насекомого, уже несущие AcMNPV, и если происходит двойной кроссинговер, то в ДНК вируса исходный ген полиэдрина заменяется чужеродным геном. Из-за отсутствия полиэдрина большинство образующихся вирионов инфекциозны, и на газоне клеток насекомого образуются зоны лизиса. Из этих зон и выделяют рекомбинантный штамм вируса, которым в дальнейшем инфицируют клетки для наработки целевого белка.

Поскольку зоны лизиса на монослое клеток не всегда хорошо различимы, были сделаны улучшенные конструкции, несущие маркерные гены, обеспечивающие образование окрашенного вещества при экспрессии в клетках насекомых. Причем экспрессию маркерного гена осуществляют с промоторов таких генов вируса, которые активны в течение всего периода репродукции вируса в клетке. Наиболее распространенный вариант маркерного гена – ген lacZ E. coli, при добавлении в среду культивирования клеток насекомого 5-бром-4-хлор-3-индолил--D-галактопиранозида (XGal) зоны активной репродукции вируса окрашиваются в синий цвет.

При использовании для экспрессии чужеродного гена промотора гена полиэдрина гетерологичный белок нарабатывается в культуре клеток через 4-5 суток. На 2000 год в этой системе уже было экспрессировано и получено в чистом виде более 500 белков, но выяснилось, что часть молекул, синтезирующихся на поздних стадиях литического цикла, не успевают подвергаться необходимым посттранскрипционным изменениям. К тому же было установлено, что линейное состояние ДНК вируса гораздо хуже вызывает инфекционный процесс. Это послужило основой для улучшения системы бакуловирусных векторов.

В частности, в геном AcMNPV добавили уникальный сайт для рестриктазы Bsu36I и в клетки насекомых вводили вирусную ДНК после ее обработки этой рестриктазой.

Репродукция вируса происходила только в тех клетках, где происходило случайное закольцовывание вирусной ДНК. Но если вместе с линеаризованной ДНК вируса вводить кольцевую ДНК вектора, в которой есть сайты для гомологичной рекомбинации с ДНК вируса (т.е. обычный вектор для экспрессии), то в результате рекомбинации резко увеличивается количество кольцевых молекул, что, естественно, приводит к репродукции вируса и формированию зон лизиса на газоне культуры. Эффективность отбора рекомбинантных вариантов при применении такого подхода повысилась с менее чем 1% до 30%.

Эта система была улучшена за счет введения еще одного сайта для рестриктазы Bsu36I в один из генов, ответственных за репликацию ДНК вируса (рис. 29).

Рис. 29. Схема улучшенной интеграции клонированного гена в ДНК AcMNPV.

Причем оба сайта для Bsu36I локализовались слева и справа от структурного гена полиэдрина в открытых рамках считывания ORF603 и ORF1629, в результате чего обработка этой рестриктазой приводила к полному удалению из ДНК вируса последовательности гена полиэдрина. Одновременно была получена векторная молекула на основе репликона pBR322, в составе которой имелись последовательности, соответствующие ORF603 и ORF1629, фланкирующие участок, состоящий из промотора гена полиэдрина, полилинкера и сайта терминации-полиаденилирования этого же гена.

При включении в вектор какого-либо гена по уникальным сайтам рестрикции полилинкера, формируется система экспрессии этого гена в клетках насекомых.

Одновременная трансфекция клеток насекомого обработанной Bsu36I ДНК вируса и ДНК такого вектора приводит к гомологичной рекомбинации этих ДНК по последовательностям ORF603 и ORF1629 и формированию за счет этого несущего нужный ген рекомбинантного бакуловируса. Наличие в векторе обширных областей гомологии с вирусной ДНК повысило выход рекомбинантов до 99%.

Во всех выше описанных системах включение чужеродного фрагмента в ДНК бакуловируса осуществлялось в клетках насекомого, что в некоторых случаях затрудняло контроль за этим процессом. Поэтому была разработана система, обеспечивающая осуществление всех рекомбинационных событий в клетках E. coli (рис. 30).

Для этого была создана специальная конструкция, включающая:

1) 5-конец гена полиэдрина;

2) ген lacZ E. coli, несущий обеспечивающую встройку транспозируемых фрагментов ДНК последовательность (так называемую att), но эта последовательность не прерывает транскрипцию lacZ-гена;

3) ген устойчивости к канамицину;

4) oriV для клеток E. coli;

5) 3-конец гена полиэдрина.

В клетках насекомого было осуществлено образование рекомбинантной ДНК, включающей такую конструкцию и весь геном бакуловируса AcMNPV и затем, после выделения такой ДНК и трансформации клеток E. coli, получена так называемая бакмида.

Для интеграции в ее состав подобранного для экспрессии в клетках насекомого гена используется две вспомогательных плазмиды.

Первая, несущая ген устойчивости к ампициллину, имеет в своем составе:

1) правый фрагмент последовательности, обеспечивающей встраивание при транспозиции (attR);

2) ген устойчивости к гентамицину (Gmr);

3) промотор гена полиэдрина (p);

4) полилинкер;

5) сайт терминации-полиаденилирования гена полиэдрина (t);

6) левый фрагмент последовательности, обеспечивающей встраивание при транспозиции (attL). Вторая плазмида, несущая ген устойчивости к тетрациклину, имеет в своем составе гены, продукты которых обеспечивают транспозицию.

Рис.30. Получение бакмиды (А), «загрузка» бакмиды путем транспозиции (Б), «загруженная»

бакмида (В).

Для получения конструкции, пригодной для экспрессии в клетках насекомого нужного гена, этот ген вставляют по уникальному сайту рестрикции полилинкера несущей ген ампициллинрезистентности плазмиды. На рис. 30 изображена уже «загруженная» целевым геном (здесь он обозначен как ген-мишень) плазмида. Генмишень уже подготовлен для экспрессии в клетках насекомых: соединен с промотором гена полиэдрина (на рис. 30 обозначен p) и заканчивается терминатором из этого же гена (обозначен t). Затем ДНК такой «нагруженной» плазмиды смешивают с ДНК плазмиды, несущей ген тетрациклинрезистентности и гены транспозиции, и этой смесью трансформируют штамм E. coli, в клетках которого находится бакмида. Высев после трансформации на среду с канамицином, гентамицином, изопропил--Dтиогалактопиранозидом (ИПТГ) и 5-бром-4-хлор-3-индолил--D-галактозидом (X-Gal) позволяет отобрать клоны с «нагруженной» нужным геном бакмидой. Сформированные такими клонами колонии имеют белую, а не синюю окраску, поскольку последовательность гена lacZ оказывается разорванной в результате транспозиции несущей нужный ген конструкции.

Клетки таких клонов проверяются на ампициллин- и тетрациклинустойчивость и для дальнейшей работы оставляются чувствительные к этим антибиотикам, но устойчивые к гентамицину варианты. После размножения таких клонов в присутствии канамицина и гентамицина из их клеток выделяют ДНК, которой и трансфецируют клетки насекомого.

В последних транскрипции подвергается только та часть чужеродного фрагмента, которая включает вводимый для экспрессии ген.

Одной из проблем при работе с клетками животных как системами для продукции чужеродных белков является выделение гетерологичного белка в чистом виде. На модели культур клеток насекомых и были отработаны подходы для улучшения условий очистки таких белков. Для этих целей были применены кодирующие короткие специфические аминокислотные последовательности фрагменты ДНК, являющиеся основой для аффинного связывания при хроматографии на колонках. Один из вариантов – это применение фрагмента, кодирующего гексагистидин (обозначается His6). Эта последовательность помещается сразу же за промотором, вплотную к ней располагается так называемый спейсерный участок, кодирующий 7-10 любых аминокислот, и далее следует последовательность, кодирующая шесть аминокислот, распознаваемых специфической протеазой. Имеющий такую «надстройку» продуцируемый клетками насекомых гетерологичный белок при пропускании белковой фракции гомогената клеток через колонку с никель-агарозой задерживается на сорбенте. Элюцию белка осуществляют промыванием колонки раствором имидазола - соединения, способного вследствие более высокого сродства к атомам никеля вытеснять гексагистидин (а, следовательно, и «привязанный» к нему белок) из сайтов связывания на агарозе.

Полученный в чистом виде белок подвергают обработке специфической протеазой, отщепляющей аффинную метку, чем достигается получение нативной формы искомого белка. В ряде случаев, когда аффинная метка не влияет на функцию белка и белок не предназначен для использования в медицинских целях, обработку протеазой можно не проводить.

При необходимости подобная принципиальная схема в настоящее время широко применяется для выделения гетерологичных белков из любых трансгенных клеток. В качестве аффинных меток чаще всего используются последовательности, связывающиеся с глутатионом; последовательности из мальтозосвязывающего белка или последовательности, дающие эпитопы, узнаваемые паратопами конкретных моноклональных антител. Естественно, что в зависимости от используемой метки подбирается сорбент в колонках и используемые для элюции растворы. В качестве сайтов для протеолититического отщепления метки также используются различные последовательности, главное, чтобы они были высоко специфичными, и подобных последовательностей не было в первичной структуре очищаемого белка. Наиболее часто это сайт, узнаваемый энтерокиназой, и сайт для тромбина.

Практическое применение культур клеток насекомых для наработки того или иного белка определяется сравнением эффективности его продукции и необходимого уровня функциональной активности с таковыми, характерными для белков, полученных в других трансгенных системах. Наиболее часто такие культуры используются для получения белков возбудителей вирусных болезней человека и животных, например, антигена вируса синего языка, антигена вируса Денге типа I, белка оболочки вируса иммунодефицита человека первого типа, капсидного белка вируса простого герпеса, гемагглютинина вируса гриппа, белка вируса Ласса, белков полиовирусов, гликопротеина вируса бешенства, гликопротеина 50 вируса псевдобешенства, антигена ротавируса обезьян. Это обусловлено тем, что пострансляционные модификации белков таких вирусов в норме определяются системами, характерными для клеток животных, которые могут отсутствовать в клетках других организмов.

Кроме имеющих потенциальное вакцинное применение вирусных белков экспрессированы в клетках насекомых ген одного из белков малярийного плазмодия, ген одного из антигенов возбудителя сибирской язвы.

Показана также возможность применения клеток насекомых для получения белков человека, имеющих отношение к ряду наследственных патологий: 1) регулятора проницаемости мембран, дефект которого приводит к муковисцидозу; 2) аденозиндезаминазы (ее дефектность приводит к связанному с обменом пуринов Т- и В-клеточному иммунодефициту); 3) липазы поджелудочной железы человека; 4) щелочной фосфатазы (снижение ее количества имеет место при гипотиреозе и при замедленном росте у детей), или белков, имеющих различное терапевтическое применение:

- и -интерферонов; интерлейкина-2; эритропоэтина. Из белков, не предназначенных для медицинского применения, можно упомянуть мышиные моноклональные антитела, ДНК-полимеразу человека (используется для репликации ДНК в ядре, -ДНК-полимераза также локализована в ядре, но используется для репарации ДНК, а -ДНК-полимераза локализована в митохондриях и обеспечивает репликацию их ДНК) и другие белки человека, получаемые для изучения их структуры и функции (например, белки различных рецепторов, выделение которых из организма в достаточных для изучения количествах затруднительно).

Трансфекция клеток млекопитающих Помимо методов генно-инженерных манипуляций с культурами клеток насекомых в конце 20-го века были разработаны подобные методы и для культур клеток млекопитающих. Связано это с давно имеющим место повышенным интересом исследователей к медицинским, ветеринарным и другим животноводческим проблемам.

Кроме того, как указывалось выше, некоторые белки позвоночных животных и человека не экспрессируются в полной мере в гетерологичном генетическом окружении из-за отсутствия тех или иных систем их посттрансляционной модификации.

Векторы для введения чужеродной генетической информации разрабатывались по уже известному принципу, предполагающему осуществление основных подготовительных манипуляций и наработку гибридных ДНК в системе E. coli, поэтому включают все те же фрагменты: тот или иной полилинкер, ген ампициллинустойчивости и oriV из pBR322.

Еще одним необходимым компонентом таких векторов является фрагмент, обеспечивающий отбор трансфецированных клеток млекопитающего (селективный маркер).

В качестве таковых наиболее часто используются несколько:

1) поставленный под тот или иной обеспечивающий транскрипцию в клетках конкретного вида животных промотор ген неомицинфосфотрансферазы из бактериальных транспозонов. Его применение оказалось возможным потому, что нечувствительные к канамицину клетки млекопитающих чувствительны к генетицину, известному как соединение G-418. Это блокирующее трансляцию на эукариотических рибосомах вещество инактивируется неомицинфосфотрансферазой за счет фосфорилирования, поэтому синтезирующие этот фермент клетки выживают.

2) ген дегидрофолатредуктазы (DHFR), обеспечивающей разрушение токсичного для клеток метотрексата. Метотрексат - это 4-амино-N10-метилптероилглутаминовая кислота (или дезокси-4-амино-N-метилфолиевая кислота), структурный аналог и антагонист фолиевой кислоты, который подавляет активность дигидрофолатредуктазы, участвующей в восстановлении дигидрофолиевой кислоты в тетрагидрофолиевую кислоту. Следствием этого является нарушение процессов синтеза и репарации ДНК, и в конечном итоге прекращение деления клеток, поэтому его в основном используют в противоопухолевой терапии. Поскольку клетки млекопитающих продуцируют этот фермент, векторы с таким селективным геном используют только для трансфекции специальных DHFR-минус клеточных линий. Существенно, что уровень устойчивости к метотрексату зависит от числа копий гена, поэтому, повышая концентрацию этого вещества в среде, можно отобрать те клетки, в которых количество копий вектора (а значит, и копий веденного на нем чужеродного гена) наиболее высокое.

3) ген глутаминсинтетазы, которая присоединяет ионы NH4+ к аминокислотам, тем самым участвуя как в синтезе аминокислот, так и в освобождении некоторых тканей и органов (в частности, мозга у человека) от образующегося там аммиака. Поэтому этот фермент всегда имеется в клетках млекопитающих, но при попадании в клетки токсичных производных аминокислот его может не хватать для их обезвреживания. Одним из таких токсичных соединений является метионинсульфоксимин. Если его добавлять в среду для культивирования клеток, выживать на ней будут лишь те клетки, в которых имеет место сверхэкспрессия гена глутаминсинтетазы, т.е. несущие много копий вектора.

И последним обязательным компонентом вектора должен быть фрагмент, обеспечивающий репликацию и стабильное наследование в клетках животных. В качестве таковых используются последовательности из геномов различных вирусов млекопитающих. Наиболее широкое применение находят вектора на основе ретровирусов, вируса простого герпеса первого типа, аденовирусов и аденоассоциированных вирусов.

Основой для получения ретровирусных векторов являются ретровирусы мыши.

Их геном состоит из двух одинаковых одноцепочечных молекул РНК, которая функционально разделена на шесть областей:

1) 5-LTR (long terminal repeat) – правый длинный концевой повтор;

2) не кодирующую белков, но ответственную за упаковку РНК в капсид область пси + (+);

3) кодирующую три белка внутренней оболочки капсида (gag);

4) кодирующую обратную транскриптазу и интегразу (pol);

5) кодирующую белок оболочки (env);

6) 3-LTR – левый длинный концевой повтор.

Жизненный цикл ретровирусов заключается в синтезе комплементарной ДНК на матрице геномной РНК сразу же после проникновения вириона в клетку и разрушения его капсида. Это возможно потому, что в капсиде вируса уже содержится несколько молекул обратной транскриптазы, упакованных в него при сборке вириона. Затем кДНК транспортируется в ядро, где встраивается в определенные сайты хромосом благодаря имеющимся в ее последовательности концевым повторам. После встраивания с сильного промотора, локализованного в 5-LTR, осуществляется транскрипция, и вновь синтезированные РНК перемещаются в цитоплазму, где в результате трансляции появляются белки Gag, Pol и Env. При этом часть молекул РНК не транслируется, а упаковывается в формирующиеся капсиды вместе с молекулами обратной транскриптазы.

Сформированные вирионы освобождаются из клетки–хозяина и могут в дальнейшем инфицировать новые клетки.

Наличие ДНК-стадии в жизненном цикле ретровирусов делает возможным осуществление всех генно-инженерных манипуляций на уровне ДНК, поскольку и она оказывается инфекциозной. Для создания ретровирусных векторов кДНК генома вируса объединили с ДНК стандартной плазмиды pBR322 E. coli и получили «обезоруженные»

укороченные варианты, лишенные областей env, pol и части области gag. Вставку ДНК чужеродного гена осуществляют в стык с оставшейся частью области gag, что делает возможной транскрипцию этой ДНК в клетке животного с вирусного промотора, локализованного в 5-LTR. Чужеродный ген (или несколько генов) могут иметь и свои пригодные для экспрессии в клетках млекопитающих промоторы.

ДНК такого гибридного вируса можно непосредственно вводить в клетки кальциевым методом или электропорацией, но эффективность перемещения ее в ядро и интеграции в хромосомы хозяина является невысокой по сравнению с таковой нормального вируса. Учитывая это, была разработана система упаковки гибридных вирусных молекул в капсиды (рис. 31).

Для этого используют специальную линию клеток мыши, в геноме которых присутствуют два укороченных варианта ретровируса. Один из вариантов представляет собой последовательность 5-LTR + gag + 3-LTR, второй – 5-LTR + pol, env + 3-LTR, т.е.

оба варианта лишены необходимой для упаковки РНК в капсид области +. В клетках такой линии синтезируются все необходимые для построения капсида белки и обратная транскриптаза, но формирующиеся капсиды остаются пустыми. Если в такие клетки дополнительно ввести несущий чужеродную генетическую информацию (на рис. 31 она обозначена как ген Х ) ретровирусный вектор, в котором имеется +-область, происходит упаковка РНК вектора, т.е. гибридной. Получающиеся вирусные частицы сепарируют от культуры клеток «пакующей» линии и используют в дальнейшем для трансфекции нужных клеток, либо (если это позволяют свойства клетки-мишени) совместно культивируют «пакующую» линию и выбранные для трансфекции клетки, а затем проводят высев на селективную среду, обеспечивающую отбор только трансфецированных клеток-мишеней. Такая система введения гетерологичных генов в клетки млекопитающих оказывается высоко эффективной, но емкость ретровирусных векторов не превышает 8 т.п.н., так как молекулы, большие, чем РНК вируса дикого типа, не упаковываются.

Поскольку ретровирусные векторные системы нашли также применение в генной терапии человека, создано множество их модификаций.

В частности, получены:

варианты вирусных частиц, способных эффективно заражать неделящиеся 1) клетки (обычный вирус «отдает предпочтение» делящимся).

Рис. 31. Схема упаковки ретровирусных векторов в капсид.

Варианты «пакующих» клеточных линий и векторов, дающие частицы с 2) измененной хозяйской специфичностью. Поскольку ретровирусы поражают не все клетки организма-хозяина, проводят так называемое фенотипическое смешивание или формирование ложного фенотипа (pseudotype formation). Для этого используют «пакующую» клеточную линию, в хромосомах клеток которой имеется только один укороченный вирус – 5-LTR + gag, pol + 3-LTR, а для получения вируса с ложным фенотипом проводят совместную трансфекцию (котрансфекцию) двумя ретровирусными векторами: один из них – это предназначенный для упаковки вектор, а второй – несущий экспрессируемый ген env из другого вируса.

Варианты с высокой, но не свойственной изначально вирусу клеточной 3) специфичностью. Для этого ген env модифицируют так, чтобы белки наружной оболочки вириона имели сродство к конкретному рецептору на поверхности тех или иных клеток.

Варианты с регулируемой экспрессией вводимого на векторе гена. Это 4) достигается постановкой этого гена под промотор, активный только в конкретных клетках или активируемый при конкретных условиях.

Не интегрирующиеся в хромосомы векторы для работы с клетками млекопитающих сконструированы на основе аденовирусов. Геном аденовирусов представлен одной двунитевой линейной молекулой ДНК размером около 36 т.п.н.

Для получения аденовирусных векторов (рис. 32) сначала «сконструировали» с помощью ретровирусного вектора клеточную линию, несущую в геноме фрагмент ДНК аденовируса с аденовирусным геном Е1. Продукт этого гена необходим для инициации образования вирусных частиц и освобождения их из клетки за счет ее лизиса. Затем получили плазмиду E. coli, содержащую фрагмент ДНК аденовируса, в середину которого можно встраивать ген, выбранный для введения в клетки млекопитающих (например, какой-либо ген для терапии, условно обозначаемый на рис. 32 как ТГ).

Фланкирующие встроенный ген последовательности вирусной ДНК не одинаковы и соответствуют: правый - нескольким единицам генетической карты вируса начиная с нуля, а левый – нескольким единицам карты перед 17 единицей. Одновременно был получен «укороченный» вариант аденовируса, из генома которого удалена область, соответствующая 9 минутам карты с нулевой по девятую и включающая Е1-ген (т.е. Е1минус вариант вируса).

В результате котрансфекции Е1+-клеток ДНК такого вируса и ДНК описанной выше плазмиды со встроенным геном за счет рекомбинации и последующей репликации происходит образование «полноразмерной» вирусной ДНК, которая вместо гена Е1 несет выбранный для введения ген. Упаковка и выход вирусных частиц с такими ДНК происходит благодаря продукту локализованного в хромосоме Е1-гена. Такие частицы и будут в дальнейшем использованы как векторные, поскольку после инфицирования ими нужных клеток и начинающейся с 5-конца транскрипции будет появляться и мРНК введенного гена, а после трансляции – продукт этого гена. В клетке при этом не будут образовываться вирусные частицы и лизироваться она не будет.

Рис. 32. Схема получения аденовирусов, несущих целевой ген.

Недостатки таких векторов – отсутствие стабильной интеграции в геном клеткихозяина (в отличие от ретровирусных векторов) и ограниченная емкость – около 7,5 т.п.н.

Для повышения емкости аденовирусных векторов был использован следующий подход.

Была сконструирована плазмида Е. coli, в которую ввели 5-концевую и 3-концевую области аденовирусной ДНК, причем эти области, размером по 4 т.п.н. каждая, несли точку инициации репликации; последовательность, отвечающую за упаковку в капсид; и терминирующую область. В эту плазмиду можно вставлять между фрагментами аденовирусной ДНК последовательности такого размера, чтобы размер плазмиды после вставки не превысил 36 т.п.н. (размер исходного генома аденовируса). При обработке определенной рестриктазой кольцевая плазмидная ДНК превращается в линейную таким образом, чтобы фрагменты аденовирусной ДНК в линейной молекуле образовывали концы. Затем такой ДНК совместно с ДНК вируса-помощника (это специальный укороченный вариант вируса, лишенный гена Е1 и последовательности, обеспечивающей упаковку) котрансфецируют клетки Е1+-линии. Вирус-помощник дает все необходимое для репликации и упаковки, но в капсиды упаковываются только векторные молекулы ДНК.

Второй недостаток – отсутствие интеграции в геном клетки-хозяина – частично преодолевается с помощью векторов на основе аденоассоциированных вирусов.

Аденоассоциированные вирусы названы так, поскольку сами по себе неспособны репродуцироваться в клетках человека. Они не патогенны, их геном представлен одноцепочечной ДНК размером 4,7 т.п.н., которая становится двунитевой после попадания в ядро клетки-хозяина и сайтспецифически встраивается в 19-ю хромосому.

После интеграции происходит транскрипция, трансляция и формирование вирионов, но только тогда, когда в этой же клетке присутствует аденовирус, белки которого и используются для правильной репродукции аденоассоциированного вируса.

Геном аденоассоциированного вируса напоминает мигрирующий элемент (транспозон), поскольку концы его ДНК представляют собой инвертированые повторы длиной 125 нуклеотидов, в которых находятся сайты инициации репликации и инициации транскрипции. Поэтому, если поместить между этими повторами какой-либо предназначенный для введения в клетки человека ген, эта конструкция будет воспроизводиться клеткой и упаковываться в капсид (рис. 33).

Максимальная емкость такого вектора исчисляется как 4,5 т.п.н., но в этом случае приходится использовать плазмиду-помощник. На этой плазмиде должны располагаться rep- и cap-гены аденоассоциированного вируса, поставленные под активный в клетках млекопитающих промотор, с которого происходит экспрессия обоих генов одновременно.

Заканчивается этот блок из двух генов сайтом терминации-полиаденилирования.

Для получения нагруженных нужной генетической информацией вирусных частиц зараженные аденовирусом клетки трансфецируют ДНК двух таких плазмид одновременно, в результате чего образуются вирусные частицы обоих вирусов, но вирионы аденоассоциированного вируса несут только предназначенный для введения в клетки млекопитающих ген. Эти вирионы отделяют от вирионов аденовируса центрифугированием и диализом. Очищенную таким образом суспензию аденоассоциированных вирусов дополнительно прогревают для инактивации не полностью удаленных (если таковые все-таки остались) частиц аденовируса, а затем используют для получения генетически измененных клеток.

Еще одна система векторных молекул для клеток млекопитающих разработана на основе вируса простого герпеса типа 1 (HSV). Этот вирус привлекает, с одной стороны, хорошо изученным геномом, состоящим из двунитевой ДНК длиной 152 т.п.н., и, с другой стороны, выраженной нейронотропностью. Он размножается в нервных клетках человека, куда проникает за счет слияния вириона с поверхностью тела нейрона, причем его репродукция не происходит постоянно, а инициируется определенными изменениями на уровне организма (т.е. он относится к латентным вирусам). Поэтому его и рассматривают как потенциальный вектор для генно-инженерной терапии длительно текущих нервных болезней.

Рис. 33. Схема получения аденоассоциированного вируса, несущего целевой ген.

В геноме вируса выявлены области, замена которых на чужеродную ДНК не сказывается на основных этапах репродукции, но введение ДНК непосредственно в геном вируса затрудняется его существенными размерами. Поэтому создана и используется специальная, основанная на особенностях репликации ДНК вируса система, состоящая из двух компонентов (рис. 34).

Первый компонент – это плазмиды E. coli, несущая два участка из генома HSV:

последовательность, необходимую для упаковки вирусной ДНК в капсид, и точку начала репликации ДНК вируса. Между этими участками располагается полилинкер, по которому и встраивается в выбранный для введения в клетки млекопитающих ген. Второй компонент – вирус простого герпеса, из генома которого удалены последовательности, обеспечивающие инициацию репликации и упаковку вирусной ДНК в капсид.

Рис. 34. Схема получения вирусов простого герпеса, несущих целевой ген.

Для получения несущих нужный чужеродный ген вирусных частиц этим вирусом инфицируют клетки, а затем трансфецируют их ДНК плазмиды с нужным геном. За счет кодируемых генами вируса белков начинается репликация ДНК плазмиды, причем происходит она, как и положено для вируса простого герпеса, по модели «катящегося кольца: в точки инициации репликации происходит однонитевой разрыв и к 3-концу присоединяются новые нуклеотиды, тогда как вторая нить остается ковалентно замкнутой матрицей. Отходящая новая нить в свою очередь становится матрицей для построения второй нити.

По достижении растущей двунитевой ДНК размера, соответствующего размеру вирусного генома, происходит отрезание фрагмента, а процесс продолжается дальше.

Параллельно идет наработка белков вирусного капсида и отрезанные фрагменты упаковываются. Таким образом чужеродный ген не только попадает в вирусные частицы, но и амплифицируется: поскольку длина плазмидной ДНК примерно в 10 раз меньше длины нормальной ДНК HSV, в каждой вирусной частице оказывается 10 копий вводимого гена. Это и послужило основанием для наименования таких плазмид ампликон-плазмидами.

Если это система по тем или иным причинам недоступна (например, нет возможности нарабатывать, для чего нужны специальные «пакующие» клеточные линии, или покупать вируса-помощника), возможно получение вектора с нужным для интродукции геном на основе рекомбинации. В этом случае используется плазмида, в которой вводимый ген находится между двумя последовательностями из так называемой незначащей области вирусного генома (удаление или замена одного из участков генома HSV длиной 30 т.п.н. не приводит к нарушению его репродукции и упаковки).

Гомологичная рекомбинация при совместном введении ДНК такой плазмиды и ДНК HSV дикого типа в культивируемые клетки может привести к включению содержащего чужеродный ген фрагмента в геном вируса и задача в дальнейшем заключается в том, как отобрать рекомбинантный вариант вируса. Это делают путем проверки вирусов из каждой отдельной бляшки на наличие нужной вставки либо гибридизацией по Саузерну, либо с помощью ПЦР. Ясно, что это более трудоемкий путь и при этом вирус несет только одну копию вводимого гена, а также необходимо гарантировано очищать культуру рекомбинантного вируса от вируса дикого типа, поскольку тот патогенен. В силу этих причин системе с ампликон-плазмидами одается предпочтение.

Для генотерапии человека разрабатываются и другие методы введения генетической информации, называемые невирусными системами доставки генов.

Среди них:

1) Бомбардировка определенных тканей через разрез микрочастицами золота, несущими молекулы ДНК с целевыми генами.

2) Использование липосом. Комплексы из положительно заряженных липидов и отрицательно заряженных ДНК, применяемые для этих целей, называются липоплексы.

Входят они в клетку хорошо, но в клетке из-за слияния с ними лизосом большая часть ДНК в них разрушается, что снижает эффективность такого приема.

3) Использование ДНК-конъюгатов. В такой методике ДНК смешивают с поли-Lлизином, к которому ковалентно пришито много молекул белка, комплементарного какому-нибудь клеточному рецептору. Поли-L-лизин образует вокруг ДНК оболочку и такая структура после введения в организм взаимодействует с рецептором. Далее этот комплекс поглощается путем эндоцитоза подобно комплексу гормон-рецептор, и поэтому образовавшаяся эндосома не сливается с лизосомами, а находящаяся в ней ДНК не повреждается.

4) Макроинъекции, при которых суспензии молекул ДНК вводят в мышцу с помощью шприца.

Частота трансфекции клеток такими методами значительно ниже, чем при использовании вирусных систем. Но их продолжают улучшать и разрабатывать, поскольку часть из них снимает характерное для вирусных систем ограничение по емкости вектора, и, вероятно, они могут понадобиться для введения в клетки искусственных хромосом человека, так называемых микрохромосом.

Разработка таких хромосом ведется на основе объединения теломерных, центромерных последовательностей и точек инициации репликации. В работе Harrington, Bokkelen, Mays, Gustashow, Willard (Nat. Genet., 1997) продемонстрировано получение трех вариантов микрохромосом: один из них был получен путем укорочения исходной хромосомы, второй – также путем укорочения и далее замены центромерной области на центромерную область другой хромосомы; третий – посредством лигирования in vitro двух теломерных областей и центромерной области. Естественно, что все это пока подготовительные работы и до практического (генотерапевтического) применения микрохромосом пока еще далеко. На мышах для введения чужеродных ДНК значительной протяженности опробована система на основе искусственных дрожжевых хромосом (YAC), которые можно вводить либо в мужской пронуклеус зиготы микроинъекцией, либо в эмбриональные стволовые клетки кальциевым методом или электропорацией.

Получение трансгенных животных Успехи в получении трансгенных растений, а также разработка методов введения чужеродной ДНК в изолированные клетки животных легли в основу применения генноинженерных приемов в селекции млекопитающих. Однако на данном направлении генетической инженерии пришлось столкнуться с определенными трудностями.

Прежде всего, это значительно более сложное строение организма высших животных по сравнению с высшими растениями, а значит и более сложное взаимодействие генов и их продуктов при реализации генетической информации. Поэтому предсказать все возможные изменения, которые могут возникнуть вследствие введения чужеродной генетической информации, для животных значительно сложнее, чем для растений. Во-вторых, невозможность использовать регенеративные свойства, присущие только отдельным тканям животного организма, для восстановления целостного организма из одной клетки. В-третьих, отсутствие у высших животных бесполого размножения, которое можно было бы использовать для поддержания линии генетически модифицированных организмов. В-четвертых, абсолютная раздельнополость высших животных, что не позволяет использовать самооплодотворение для таких же целей и приходится использовать близкородственные скрещивания. В-пятых, невозможность осуществления полного развития организма высших млекопитающих из зиготы в искусственных условиях (вне материнского организма). Тем не менее, начиная с середины годов прошлого века, развернулись работы по получению генетически 80-х модифицированных животных и за относительно короткий срок были достигнуты значительные успехи.

Модельным объектом для трансгеноза высших животных стали легко разводимые человеком лабораторные мыши. Основными методами введения генетической информации в их организм являются трансфекция бластомеров 8-клеточного эмбриона с помощью ретровирусных векторов (рис. 35), введение генетически модифицированных с помощью тех же векторов стволовых клеток в эмбрионы на более поздних стадиях развития и прямое введение ДНК в зиготу до слияния мужского и женского ядер.

Последний метод, получивший название метода микроинъекций, несмотря на технические сложности и трудоемкость, получил наибольшее распространение (рис. 36).

Для его реализации у самок белых мышей стимулируют овуляцию путем введения сыворотки беременной лошади и через 48 часов – хорионического гонадотропина человека, в результате чего в яичниках мыши образуется более 30 яйцеклеток вместо обычных 5-10. Затем осуществляют скрещивание таких самок с самцами и их быстрое умерщвление для вымывания оплодотворенных яйцеклеток из яйцеводов. Полученные таким образом клетки пока не являются полноценными зиготами, поскольку в них еще не произошла кариогамия (слияние ядер). С использованием микроманипулятора, под микроскопом поочередно фиксируют каждую клетку и с помощью инъекционной микропипетки (тонкая стеклянная трубочка, соединенная с создающим давление механизмом) в ядро слившегося с яйцеклеткой сперматозоида (мужской пронуклеус) вводится суспензия молекул ДНК, содержащих необходимую генетическую информацию.

Рис. 35. Получение трансгенных мышей путем трансфекции 8-клеточных эмбрионов.

Когда ядро яйцеклетки (женский пронуклеус) и ядро сперматозоида сливаются и получается полноценная зигота, она микрохирургическим путем имплантируется в матку так называемой суррогатной матери – самки, которая была перед этим скрещена с вазэктомированным самцом (в семенной жидкости таких самцов нет сперматозоидов), поскольку у мышей не разработаны другие методы (например, гормональные) для подготовки матки самки к имплантации.

В матку одной самки вводят от 25 до 40 зигот, для того, чтобы хотя бы часть из них имплантировалась нормально, и началось дальнейшее развитие эмбрионов. Через три недели рождается трансгенное потомство, которое оценивается в дальнейшем на наличие введенных генов и выраженность желаемого признака.

Рис. 36. Метод микроинъекций в мужской пронуклеус.

Метод трудоемок и требует специальной подготовки: квалифицированный специалист в течение рабочего дня подвергает микроинъекции несколько сотен яйцеклеток, при этом часть яйцеклеток повреждаются и становятся непригодными для имплантации. Кроме того, имеются определенные трудности и в ходе собственно имплантации, а также не каждая имплантированная зигота в дальнейшем развивается нормально (поэтому их имплантируют больше, чем в норме может развиться в матке мыши). К сожалению, и часть родившихся детенышей могут оказаться мало жизнеспособными и умирают на ранних стадиях постэмбрионального развития.

Для дальнейшего выращивания оставляют только тех выживших потомков, у которых произошло закрепление введенной генетической информации. Для их идентификации производят выделение ДНК из небольшого количества тканей животного (у мышей для этого используют фрагмент хвоста) и осуществляют ПЦР с необходимыми праймерами. Анализ продуктов ПЦР позволяет отобрать необходимых животных (для мышей из 1000 имплантированных зигот получается от 30 до 50 трансгенных потомков) и по достижению половой зрелости проводить получение чистых линий путем традиционного инбридинга. Получаемое в таких скрещиваниях потомство анализируется тем или иным способом на наличие необходимых генов в гомозиготном состоянии. На этом этапе также встречаются определенные трудности, связанные уже с выражением интегрированных генов, вследствие чего окончательный выход (получение чистой линии) оказывается еще менее эффективным. Однако, если чистая линия уже получена, то ее поддержание уже не составляет особых проблем и возможно практическое использование трансгенных животных в научных целях.

Еще один подход – это введение генетически модифицированных стволовых клеток в бластоцисту (рис. 37). Для этого клетки из бластоцисты (зародыша на стадии начала формирования второго зародышевого листка) изолируют и поддерживают какое-то время в культуре. Такие клетки (сокращенно называемые ES-клетки) способны к пролиферации и обладают плюрипотентностью, т.е. способностью в дальнейшем развиваться в клетку любой ткани. Посредством трансфекции с использованием тех или иных векторов на основе вирусов млекопитающих в эти клетки вводится чужеродная генетическая информация и дальнейшая задача состоит в том, чтобы отобрать те варианты клеток, в которых произошла встройка в определенный участок генома. Дело в том, что интеграция чужеродного фрагмента не должна нарушить ни процессы развития эмбриона, ни процессы постэмбрионального развития до половой зрелости.

Уже известны некоторые сайты генома мыши, инсерции в которые оказывались удачными в этом отношении, поэтому в векторе, предназначенном для трансфекции ES-клеток, маркерный ген и и целевой ген располагают между последовательностями, гомологичными последовательностям из таких сайтов (рис. 38).

В качестве маркерного гена используют ген Neor, продукт которого придает клеткам млекопитающих устойчивость к G-418 (генетицину), поэтому культивирование клеток на среде с этим соединением позволяет отобрать те из них, в которых произошла встройка векторной молекулы в геном (это так называемая позитивная селекция). Однако, иногда встройки могут происходить в различные участки генома, в том числе и важные для развития эмбриона и потомства, поэтому в составе вектора находятся еще два гена, наличие которых позволяет убрать клетки с ненужными вставками.

Рис. 37. Получение трансгенных животных с помощью трансфекции эмбриональных стволовых клеток.

Рис. 38. Позитивно-негативная селекция для направленной интеграции в геном млекопитающих.

Это два гена тимидинкиназы из геномов разных штаммов вируса простого герпеса – HSV-tk1 и HSV-tk2 (неодинаковые гены взяты для того, чтобы избегать гомологичной рекомбинации и выщепления вследствие этого из векторной ДНК целевой конструкции).

Они располагаются в векторе слева и справа от нужных для направленной интеграции гомологичных фрагментов. В том случае, когда встраивание произошло случайно, не по этим гомологичным последовательностям, то в геноме клетки оказывается хотя бы один из генов тимидинкиназы (позиция А на рис. 38). Его присутствие в геноме легко обнаружить при выращивании клеток на среде с ганцикловиром, поскольку он под воздействием этого фермента превращается в токсическое для клетки соединение. Таким образом, если после трансфекции ES-клетки поместить на среду, одновременно содержащую и генетицин (G-418) для позитивной селекции и ганцикловир - для негативной, будут размножаться только те клетки, в которых произошла интеграция в нужный сайт хромосомы (позиция Б на рис. 38).

Еще один метод отбора клеток с правильно произошедшей интеграцией основан на ПЦР, но для этого используют другие векторы (рис. 39). В таких векторах рядом с предназначенным для введения геном, между ним и одной из необходимых для гомологичной рекомбинации последовательностей, располагают короткую уникальную последовательность (US), которая нигде больше в геноме животного не встречается (она может быть как природной, например, из генома бактерий, так и синтетической). Для идентификации нужных клеток необходимы два праймера: один из них (Р1) комплементарен этой уникальной последовательности, а второй (Р2) – последовательности из того сайта хромосомы, в который предполагается встройка. Если после амплификации ДНК из трансфецированных клеток выявляется фрагмент предусмотренного размера, то, значит, именно в этих клетках интеграция произошла в нужное место хромосомы.

Рис. 39. Идентификация клеток с интеграцией целевого гена в нужный сайт с помощью ПЦР.

Далее клетки такого клона с использованием микроманипулятора вводят в бластоцисту мыши, и затем имплантируют эту бластоцисту в матку суррогатной матери.

После этого по описанной выше схеме получают чистые трансгенные линии.

Эмбриональные стволовые клетки используют также, чтобы получить животных с дефектом по какому-либо конкретному гену (рис. 40).

Рис. 40. Нокаут гена. smg – селективный маркерный ген.

Это необходимо для изучения функции этого гена и получение около 300 линий таких мышей уже позволило идентифицировать многие гены млекопитающих.

Для проведения так называемого «нокаута гена» создают специальные конструкции, в которых селективный маркерный ген (smg), например, тот же ген Neor, размещают внутри последовательности предназначенного для «нокаута» гена с таким расчетом, чтобы протяженные участки гена справа и слева от маркера обеспечивали успешную рекомбинацию с геном дикого типа в клетках млекопитающих (обычно по одному или несколько экзонов, промоторную область и сайт терминации-полиаденилирования).

Улучшенный вариант таких конструкций несет гены тимидинкиназы, расположенные по обе стороны от изображенной на рис. 40 последовательности. Это дает возможность провести негативно-позитивную селекцию (см. рис. 38 и пояснения к нему в тексте) эмбриональных стволовых клеток и далее по схеме, изображенной на рис. 37, получить нокаутную мышь. Общая схема всего этого процесса показана на рис. 41.

Рис. 41. Общая схема получения нокаутных мышей.

Успехи, достигнутые в получении трансгенных мышей с помощью вирусных векторных систем значительны, но в ряде случаев необходима одновременная экспрессия сразу нескольких генов, причем эта экспрессия должна быть максимально приближенной к экспрессии этих же генов в родном окружении.

Для этого емкости вирусных векторов не хватает, поэтому были проведены эксперименты по введению в зиготы и эмбриональные стволовые клетки млекопитающих искусственных дрожжевых хромосом (YAC) методом микроинъекций в мужской пронуклеус. Так были получены мыши, несущие 5 функциональных генов -гемоглобина человека (введенный фрагмент имел протяженность 250 т.п.н.), и мыши, способные продуцировать человеческие антитела.

В последнем случае собственные гены мышей, кодирующие легкие и тяжелые цепи иммуноглобулинов были «нокаутированы» двумя вставками: кластера генов Н-цепей человека, включающего 4 V-гена, 16 D-генов, 6 J-генов и всех генов С и С; и кластера, содержащего 4V-гена, 5 J-генов и С-ген.

Уже даже такие мыши синтезировали человеческие антитела в ответ на введение в их организм некоторых антигенов и были даже получены гибридомы на основе их Влимфоцитов, но естественно, что разнообразие таких антител по специфичности было ограничено. Поэтому в мышей обычной линии методом слияния ES-клетки бактериальных сферопластов с клетками мыши) была введена искусственная дрожжевая хромосома (работа Mendez M.J. et al., 1997 в Natl. Genet., причем общее количество авторов в этой работе – 21 человек) размером 1000 т.п.н., содержащая 66 VH-генов, 30 DHгенов, 6 JH-генов и все гены цепей,, и (эта хромосома была сделана путем обединения 4 ранее созданных YAC).

Одновременно в другие ES-клетки этой же линии мышей ввели созданную из трех уже существовавших YAC дрожжевую хромосому размером 800 т.п.н. с 32 V-генами, 5 J-генами и С-геном. Затем путем микроинъекций в бластоцисту получили две отдельных линии мышей: с «YAC легких цепей» и с «YAC тяжелых цепей». Мышей из каждой линии скрещивали с мышами линии с «нокаутироваными» генами собственных иммуноглобулинов и путем инбридинга добились получения чистых линий, у которых не экспрессировались мышиные иммуноглобулины (надо было освободиться от локусов, внесенных мышами с YAC). И наконец, при аутбридинге мышей уже этих последних чистых линий были получены мыши, которые в ответ на введение трех очень разных антигенов дали полноценные человеческие антитела, и полученные на основе их клеток мышиные гибридомы были использованы для получения человеческих моноклональных антител.

Однако основные усилия в получении трансгенных мышей направлены на создание моделей наследственных болезней человека, таких как артрит, мышечная дистрофия, нейродегенеративные нарушения, болезнь Альцгеймера, образование опухолей и других.

На мышах также отрабатываются варианты получения необходимых для изучения механизмов тех или иных болезней белков, получить которые в других системах экспрессии (бактериях, дрожжах, растениях, клетках насекомых) не удается. Здесь предполагается создание системы секреции таких белков в молоко (вставки в последовательность гена -казеина козы «сработали» на мышах), чтобы потом получить трансгенный крупный или мелкий рогатый скот и иметь мощный источник необходимого белка.

С этой точки зрения наиболее подходящими животными являются коровы, в молоке которых около 35 г/литр белка, а годовые удои высокопродуктивных пород порядка 10000 литров. Методику получения трансгенных коров начали отрабатывать сначала 90-х годов 20-го века и она заключается в следующем.

Ооциты коров вымывают из яичников убитых на бойнях животных и in vitro создают им условия для созревания в яйцеклетки. Здесь же проводится их оплодотворение спермой быка, после чего клетки особым образом центрифугируют, чтобы уплотнить желток и сделать тем самым видимым мужской пронуклеус. Далее проводят микроинъекции необходимой генетической конструкции по стандартной методике и переносят зиготы в условия, обеспечивающие развитие зиготы в эмбрион. Полученные in vitro эмбрионы вводят в матку коровы, находящейся на стадии течки и они без хирургического вмешательства имплантируются в стенку матки. На определенной стадии развития эмбриона в матке отбирают небольшое количество клеток зародышевых оболочек и посредством ПЦР удостоверяются в присутствии в геноме плода последовательности введенного гена. Метод пока низко эффективен, но реален.

Считается, что постепенно его этапы будут усовершенствованы, и получение трансгенного крупного рогатого скота для медицинских и сельскохозяйственных целей станет обычным делом.

В медицинском аспекте предполагается экспрессия нужных генов в клетках молочной железы и получение в дальнейшем из молока необходимых для терапии тех или иных болезней человека белков (например, белков системы свертывания крови для помощи гемофиликам), а в сельскохозяйственном – получение не содержащего лактозу молока путем экспрессии гена лактазы (некоторые люди плохо переносят потребление молочных продуктов именно из-за присутствия в них лактозы), получение молока обогащенного -казеином посредством гиперэкспрессии собственно коровьего гена (необходимо для производства сыров), получение животных, устойчивых к различным инфекционным заболеваниям (стоимость ветеринарного обслуживания животных составляет около 20% стоимости продуктов животноводства). Реализация последней цели должна заключаться во введении в геном животных конкретных генов вариабельных доменов иммуноглобулинов, обеспечивающих образования паратопов, специфичных для наиболее важных эпитопов антигенов патогенных для данного вида вирусов и бактерий.

Подобный подход в получении резистентных пород потенциально применим и к другим сельскохозяйственным животным.

Получение трансгенных овец и коз пока обсуждается в основном с точки зрения использования их молока для получения медицинских препаратов, поскольку генетические конструкции для экспрессии генов человека в клетках молочной железы этих животных получены и апробированы. В этих гибридных ДНК используются промоторы гена -лактоглобулина, гена -казеина и гена S1-казеина, а среди клонированных генов человека – ген активатора плазминогена, ген -антитрипсина (при отсутствии этого белка развивается эмфизема, дефицит ингибитора сывороточных протеаз, поражение легких, цирроз печени), ген фактора IX системы свертывания крови (белок нужен для оказания помощи людям с В-формой гемофилии), ген лактоферрина, ген урокиназы, ген интерлейкина-2 (ИЛ-2 находит применение при лечении меланомы, глиобластомы и рака почек), ген CFTR (cystic fibrosis transmembrane regulator, трансмембранный белок, нарушения в структуре которого приводят к муковисцидозу образованию большого количества слизи в дыхательных путях и как следствие этого повышению заболеваемости таких людей респираторными болезнями в несколько раз и их высокой смертности из-за аллергической реакции на нуклеиновые кислоты возбудителей). Существенно, что трансгенные овцы и козы в большинстве случаев не имеют отклонений в лактации, а вскармливаемое таким молоком потомство - отклонений в развитии. Из перспектив сельскохозяйственного применения трансгенного мелкого рогатого скота упоминают только овец с повышенной скоростью роста шерсти. Этот вариант был получен путем введения кДНК гена инсулиноподобного фактора роста 1 овцы под промотором гена кератина мыши.

Получение трансгенных свиней также имеет место, причем ввиду близости физиологических и тканевых характеристик свиньи и человека, здесь также в основном преследуют медицинские цели. В частности, предполагается разработать и осуществить трансгеноз свиньи с целью использования органов таких животных для пересадок человеку. Одно из препятствий при межвидовой трансплантации – это так называемое гиперострое отторжение, проявляющееся почти сразу же после пересадки. Оно вызывается осаждением антител на поверхности клеток пересаженного органа и активацией вследствие этого системы комплемента по классическому пути, что, естественно, моментально разрушает клетки. Выяснилось также, что основным антигеном, который вызывает образование антител у выбранных как модель обезьян, является углеводный компонент поверхностных белков клеток свиньи. Предполагается, с одной стороны, «подобраться» к генам свиньи, кодирующим поверхностные антигены и изменить их так, чтобы убрать или модифицировать этот углеводный компонент, а с другой стороны, ввести в геном свиньи гены человека, контролирующие образование ингибиторов системы комплемента, защищающих собственные клетки от его действия.

Эти гены уже клонированы и экспрессированы в организме свиньи и одно из животных действительно имело клетки, не повреждающиеся комплементом человека в опытах in vitro. После пересадки тканей такой свиньи приматам отторжение все-таки наблюдалось, но не по схеме гиперострого отторжения. Вероятно, шло отторжение за счет активации макрофагов Т-хелперами первого типа как это обычно имеет место при внутривидовых пересадках органов.

Еще одним успешным в этом направлении трансгенозом свиньи считается получение животных, продуцирующих человеческий гемоглобин. В этом случае в геном свиньи ввели два гена -цепи гемоглобина человека, один ген -цепи гемоглобина и регуляторную область гена -цепи под промотором свиного гена -цепи гемоглобина.

Перспективы применения таких свиней – приготовление из их крови компонентов кровезаменителей.

В сельскохозяйственном аспекте пытались получить породу быстрорастущих мясных свиней путем введения гена бычьего гормона роста под промотором гена металлотионеина, но хотя трансгенные животные и быстрее росли, у них обнаруживались язвы желудка и кишечника, почечная и сердечная недостаточность, воспаления суставов и снижение защитных свойств слизистой оболочки дыхательных путей (повышенная заболеваемость пневмониями).

Параллельно с проблемами введения новой генетической информации в клетки млекопитающих решалась и проблема получения идентичных потомков, поскольку даже внутрисемейные скрещивания не гарантируют точного воспроизведения генотипа уже полученного трансгенного животного. Решение пока видят в поиске клеток эмбриона или взрослого организма, которые полностью сохраняли бы плюрипотентность, т.е способность экспрессировать все гены, необходимые для начальных этапов эмбрионального развития. Если такие клетки обнаруживаются (у коров это клетки эмбриона, у овец – клетки эпителия молочной железы, причем, вероятно, не любая из клеток, поскольку в работе Wilmut I. et al., (1997) было использовано 277 клеток, из них только 29 дали эмбрионы, а до рождения развился только один), то далее осуществляют перенос ядра такой клетки в цитоплазму яйцеклетки, из которой предварительно свое гаплоидное ядро удаляют (рис. 42).

Рис. 42. Схема клонирования овцы.

В экспериментах с клетками молочной железы овцы введение ядер осуществляли с помощью слияния клеток с применением полиэтиленгликоля, на коровах – с помощью микроманипулятора. На следующем этапе добиваются дробления такой своеобразной зиготы in vitro и имплантируют ее в матку «суррогатной» матери.

Проводятся также исследования по созданию системы получения трансгенных птиц.

Сложности заключаются в том, что у птиц при оплодотворении в яйцеклетку проникает, как правило, несколько сперматозоидов, но лишь один из них сливается с ядром. Поэтому осуществлять инъекции в мужской пронуклеус считается нецелесообразным, а проверка возможности введения ДНК в цитоплазму яйцеклетки показала, что в ядро такая ДНК не проникает. Были проверены возможности трансфецирования клеток зародыша кур и перепелов стандартными ретровирусными векторами млекопитающих и оказалось, что это возможно. Часть полученных таким образом цыплят и перепелят наследовали маркерный ген и не продуцировали вирусных частиц, но опасения, что присутствие ретровирусного генома может иметь нежелательные последствия при потреблении полученных от таких птиц продуктов, заставили дальше отказаться от такого подхода. К настоящему времени используют метод введения ДНК в бластомеры куриных эмбрионов с помощью липосом (рис. 43).

Рис. 43. Получение трансгенных птиц.

Для этого из слегка насиженных яиц извлекают эмбрион, разделяют его на клетки и смешивают их с суспензией липосом, содержащих чужеродную ДНК. Добиваются слияния липосом с клетками, а затем вводят суспензию таких клеток в подзародышевую область свежеотложенных яиц, которые перед такой процедурой подвергают несильному (540-660 рад в течение часа) облучению. Облучение убивает часть клеток исходного зародыша, и после введения трансфецированных бластомеров они с большей вероятностью войдут в состав востанавливающегося после облучения эмбриона. Если из такого яйца в дальнейшем вылупливается птенец, то в части его клеток можно обнаруживать присутствие введенного гена. Такие цыплята называются химерными и их в дальнейшем используют для скрещивания. Анализ потомства позволяет выявить особи, у которых трансген присутствует во всех клетках, и такая птица становится основателем чистой линии, получаемой уже стандартным инбридингом.

Потенциальное хозяйственное применение трансгенных птиц видят в следующем:

получение пород кур, устойчивых к различного рода инфекциям (бактериозы и болезни, вызываемые одноклеточными животными, наносят серьезнейший ущерб промышленному птицеводству); пород с измененным составом желтка и мяса (меньше жира и холестерола); пород с измененным составом белка, причем предполагается поставить под промоторы генов овальбумина гены ряда используемых в медицинских целях белков, чтобы потом извлекать эти белки из яичного белка.

Еще одна группа позвоночных животных, которых уже коснулась своим крылом генетическая инженерия – это рыбы. Методически работа с яйцеклетками рыб является самой несложной и введения ДНК в икринки можно осуществлять микроинъекцией или электропорацией без особого труда. Тем более, что введение линеализированной ДНК просто в цитоплазму оплодотворенных яйцеклеток или бластомеров четырехклеточного зародыша оказывается вполне эффективным. Трансфецированные икринки просто оставляют в воде оптимальной для развития эмбриона температуры и выход трансгенного потомства может достигать 70%. Наличие трансгена у мальков определяют посредством ПЦР.

Из успехов трансгеноза рыб упоминают работу с атлантическим лососем Salmo salar, в которой была использована кДНК гена гормона роста лосося (чавычи), поставленная под промотор и сайт полиаденилирования гена антифризного белка североамериканской бельдюги. Экземпляры потомства с такими генами в возрасте одного года весили более чем в два раза больше обычных лососей, выращенных в таких же условиях (рис. 44).

Рис. 44. Сравнение трансгенного и обычного лососей.

К 2012 году в США уже существовала ферма по разведению такого лосося, которая имеет поголовье в несколько тысяч особей. В ноябре 2015 года Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) выдало разрешение на торговлю генетически модифицированным лососем AquAdvantage.

Этот лосось разводится на фермах компании Aquabounty, расположенных на территории Канады и Панамы.

Обсуждается возможность получения пород разводимых рыб (форель, карп), устойчивых к болезням и стрессовым воздействиям при скученном содержании.

Работы по получению хозяйственно полезных рыб получили несколько неожиданное продолжение. В Национальном университете Сингапура в качестве модельного объекта по отработке методов генетической инженерии рыб использовали аквариумную рыбку данио рерио. В качестве маркерного гена, указывающего на экспрессию вводимой генетической информации, был применен ген зеленого флюоресцирующего белка GFP (green fluorescence protein) Aequarea victoria. Выступая на конференции в 1999 году, докладчик Чжиюань Гун показал фотографии в качестве иллюстрации к тому, что изучалось. Это увидел специалист по разведению аквариумных рыб и предложил реализовать коммерческий проект по направленному получению таких рыб для разведения. По заказу компании в геном данио рерио был встроен ген, выделенный из морского коралла Discosoma, который отвечает за синтез дающего красное свечение белка RFP (red fluorescence protein). Желтую или оранжевую окраску создали путем комбинирования генов GFP и RFP методами традиционной селекции и отбором потомков с разной степенью экспрессии этих генов. Официальным производителем флуоресцирующих рыб (ТК-1, TK-2, ТК-3), является тайваньская корпорация Тайконг (рис. 45).

Рис. 45. Трансгенные Danio rerio Первыми коммерческими генетически модифицированными рыбками стали данио рерио и медака. Оффициально в продаже трансгенные аквариумные рыбки появились в 2003 году в Тайване и других азиатских странах. В 2005 году их реализация началась в США под коммерческим брендом GloFish – торговая марка американской компании Yorktown Technologies LP. В 2012 году уже продавались светящиеся рыбки следующих цветов: «Красная звездная рыбка» (англ. Starfire Red), «Зелёное электричество» (англ.

Electric Green), «Апельсиновый лучик» (англ. Sunburst Orange), «Синь Космоса» (англ.

Cosmic Blue) и «Пурпур Галактики» (англ. Galactic Purple). Разнообразие цветов и оттенков получено путем использования генов различных коралловых полипов. Причем теперь это не только данио рерио и медака, а еще тернеция, скалярия и цихнида.

Поскольку на подобного рода товар имеется постоянно возрастающий спрос, работы по созданию новых пород трансгенных декоративных рыб продолжаются, и это направление в генетической инженерии животных считается наиболее перспективным и быстро реализуемым.

Заканчивая разговор о трансгенных эукариотических организмах, можно отметить, что в последней четверти 20-го века, благодаря прогрессу в области молекулярной биологии, человечество получило новые возможности. Теперь человек не только совершенствует путем искусственного отбора созданные природой организмы, человек направленно изменяет их путем введения дополнительной генетической информации вне зависимости от уровня организации: объектами генетической инженерии являются все живые существа, начиная от вирусов и бактерий и заканчивая самыми сложными по строению и функционированию животными.

Уже в первом десятилетии 21-го века эти возможности существенно расширились:

найдены и опробованы методы направленного изменения исходного генетического материала живых существ без внесения дополнительной, чужеродной для них, генетической информации. Это направление человеческой деятельности получило условное наименование редактирование геномов, и по сути своей не должно рассматриваться в курсе «Трансгенные эукариотические организмы» – ведь переноса генов одних организмов в другие здесь не происходит. Однако то, что может быть получено в результате практического применения таких методов, является закономерным продолжением генно-инженерного направления, и обойти вниманием эти методы было бы неверным.

Современные методы редактирования геномов: перспективы и возможные последствия Уже описанные в нашем курсе варианты изменения активности генов различных организмов, называемые условно «нокдаун» и «нокаут», базируются преимущественно на инсерции в геном несвойственных изначально организму нуклеотидных последовательностей.

Основанный на явлении РНК-интерференции нокдаун гена достигается в большинстве случаев экспрессией с сильного промотора этого же гена, но транскрибируемого в противоположном направлении. Такой, условно говоря, «перевернутый» ген фактически является новой, изначально не свойственной этому организму генетической информацией, что, по сути, эквивалентно введению чужеродного гена.

Вариант нокаута гена за счет инсерции в его структурную часть какого-либо селективного (маркерного) гена, вне всякого сомнения, представляет собой трансгенез, поскольку такие маркерные гены практически всегда чужеродны для мутируемого организма.

Поэтому появившийся в 1996 году метод направленного прижизненного мутагенеза с использованием так называемых химерных нуклеаз стал принципиально новым подходом.

Первым вариантом используемых в таком методе генетических конструкций стали плазмиды, включающие последовательность, кодирующую ДНК-связывающий сайт типа «цинковые пальцы», и последовательность, кодирующую каталитический домен из нуклеазы FokI Flavobacterium okeanokoites. Эти последовательности объединены так, что при экспрессии с одного промотора в клетке появляется несуществующий в природе белок, представляющий собой, условно говоря, рестриктазу направленного действия или, говоря по-другому, «управляемую рестриктазу». Такие белки получили название zinc finger nucleases (нуклеазы с «цинковыми пальцами»), сокращенно ZFNs. Схема «управления» такими рестриктазами заключается в следующем.

Известно, что определенные входящие в работающие в клетках эукариот транскрипционные комплексы белки, (например, белок Zif/268 человека, Kruppel-белок Drosophila, белки ADRI и GAL4 дрожжей, белок E1A аденовируса и др.) связываются с большой бороздкой двуспиральной молекулы ДНК специфично. Специфичность определяется небольшими расположенными на поверхности белковой глобулы выростами, которые стабилизированы одним или двумя ионами Zn+2 (рис. 46). Причем каждый «палец» взаимодействует с определенным триплетом нуклеотидов, благодаря чему такие белки связываются с промоторными областями конкретных генов.

Рис. 46. Схема структуры домена типа «цинковый палец»

Направленно подбирая кодирующие такие «пальцы» нуклеотидные последовательности, формируют тот участок химерного гена, от которого зависит связывание химерной нуклеазы с мишенью, то есть с тем фрагментом генома, который хочется изменить. Естественно, что для этого надо иметь сведения о последовательности нуклеотидов такой мишени и выбрать те участки в ней, которые нигде больше в данном геноме не встречаются.

Причем для получения разреза в этом запрограммированном участке ДНК подбираются две последовательности: одна нужна для прикрепления химерной нуклеазы к смысловой нити ДНК, вторая – для прикрепления к комплементарной нити. Расстояние в ДНК-мишени между двумя такими участками прикрепления должно быть 12-25 пар нуклеотидов. Это обусловлено тем, что нуклеаза FokI делает двунитевой разрез только в димерном состоянии, то есть к ДНК-мишени должны присоединиться две химерных нуклеазы с разными наборами «цинковых пальцев».

При введении в эукариотические клетки генетических конструкций, обеспечивающих экспрессию двух химерных нуклеаз, на ДНК-мишени образуется гетеродимер, который и вносит в мишень двунитевой разрез (рис. 47).

Рис. 47. Схема работы химерной нуклеазы ZFN

Восстановление клеткой ДНК после полученного двунитевого разрыва может происходить по двум путям. Один из них – негомологичное соединение концов, при котором с высокой частотой происходит образование либо инсерций, либо делеций, что приводит к мутации (общее название таких мутаций индели). Несмотря на то, что такие изменения в последовательности нуклеотидов невелики по размерам, сдвиг рамки считывания высоко вероятен, что и приводит к отсутствию функционального белка, кодируемого этим геном. Это и является основанием для применения ZFNs для нокаута целевых генов без вставки дополнительной генетической информации.

Опыт применения ZFNs на различных эукариотических клетках показал, что формирование ДНК-связывающих нуклеотидных последовательностей для каждой новой мишени трудоемко и достаточно дорого в финансовом отношении. Кроме того, точность взаимодействия их с ДНК-мишенями является не абсолютной по причине сбоев в распознавании триплетов такими искусственно созданными «цинковыми пальцами». В ряде случаев выход нецелевых мутантных клеток оказывался очень существенным. В совокупности это в значительной мере ограничивало широкое применение такой методики редактирования активности генов, а предпочтение отдавалось традиционной методике получения нокаута генов путем инсерций маркерных генов за счет гомологичной рекомбинации.

Ситуация существенно поменялась в начале 10-х годов нашего века. И помогли в этом, казалось бы, далекие от генетической инженерии новые особенности прокариотических организмов, открытые благодаря успехам молекулярной биологии. Это еще два примера того, как фундаментального характера исследования в биологии приобретают неожиданное практическое воплощение. Подобно тому, как исследования особенностей репродукции бактериофагов привели к открытию рестриктаз, ставших одним из основных инструментов генетической инженерии, подобно тому, как выяснение сути особой формы паразитизма – генетической колонизации хозяина агробактериями привело к созданию трансгенных растений, открытие двух ранее неизвестных природных явлений стало основой для создания эффективных методов редактирования геномов.

TALEN-опосредованные генно-инженерные системы Одно из таких явлений – регуляция некоторыми патогенными бактериями транскрипции генов в клетках организма-хозяина. Основные сведения по этому вопросу получены на фитопатогенных бактериях рода Xanthomonas (Xanthomonas citri, Xanthomonas malvacearum, Xanthomonas campestris pv. campestris, X. oryzae pv. oryzae и других), которые в ходе взаимодействия с растением через систему секреции типа III (T3SS) вводят в цитоплазму растительных клеток особые белки-эффекторы. Эти белки действуют подобно активаторам транскрипции в ядре растительной клетки, за что и получили название Transcription Activator-Like Effectors, сокращенно TALE. Под влиянием этих белков транскрибируются гены растения, продукты которых необходимы для размножения бактерий в растении и системного распространения их по растению.

Эти белки у различных штаммов ксантомонад различаются по специфичности взаимодействия с промоторными областями различных генов, но при этом имеют общую структуру (рис. 48).

Рис. 48. А – функциональная схема строения TALE, В – комплекс эффектора (обозначен красным цветом) и ДНК, С – код TALE: RVD (Repeat Variable Diresidues) – 12-ый и 13-ый аминокислотные остатки в тандемных повторах: NI – аспарагина и лейцина, HD – гистидина и аспарагиновой кислоты, NN – два остатка аспарагина, NG – аспарагина и глицина.

Начиная от N-конца, в таком белке имеются два участка, которые обеспечивают доставку молекулы в цитоплазму растительной клетки из клетки бактериальной. Один из них – это лидерная последовательность для проведения белка через аппарат системы секреции типа III, второй – сайт взаимодействия со вспомогательным белком-шапероном HpaB, без которого транспорт не происходит.

Затем следует центральный участок, который является главным отличительным признаком всех белков семейства TALE. Он представляет собой своеобразную кассету тандемных повторов, каждый из которых состоит из 33-35 аминокислотных остатков.

Отличаются эти повторы друг от друга только остатками аминокислот, расположенных в таких последовательностях на 12-ой и 13-ой позициях. Из-за этого такие остатки получили название RVDs (от англ. repeat-variable di-residues – вариабельные сдвоенные остатки повтора). Каждый такой повтор в конформационном отношении представляет собой две закрученные относительно друг друга -спирали, и этот своеобразный стержень заканчивается петлей, в которой как раз и находятся 12-ый и 13-ый аминокислотные остатки. Последний повтор в таком ряду повторов состоит из 20 аминокислотных остатков и поэтому носит название полуповтора.

В 2007 году было показано, что именно этот участок белка непосредственно связывается с молекулой ДНК, а в течение двух последующих лет двумя группами исследователей был расшифрован принцип и своеобразный код, лежащий в основе такого связывания. Оказывается, что каждый повтор своей петлей (то есть 12-м и 13-м остатками) прикрепляется к конкретному нуклеотиду в значащей (смысловой) цепи двуспиральной молекулы ДНК, причем 12-ый остаток играет роль своеобразного стабилизатора пространственной конформации, а 13-ый непосредственно взаимодействует с нуклеотидом. Показано, что остатки аспарагиновой кислоты и аспарагина образуют водородные связи с азотистыми основаниями нуклеотидов, а изолейцина и глицина присоединяются к нуклеотидам за счет сил Ван-дер-Ваальса.

Несмотря на то, что такой код вырожден (RVDs NN может связывать как гуаниловый нуклеотид, так и адениловый), наиболее часто в различных TALE встречаются RVDs следующего состава: NI – остатки аспарагина и изолейцина, HD – гистидина и аспарагиновой кислоты, NN – два остатка аспарагина, NG – аспарагина и глицина. Схема связывания для них такова: NI связывается с адениловым нуклеотидом, HD – с цитидиловым, NN – с гуанидиловым, в NG – с тимидиловым.

Учитывая, что в одном эффекторном белке более десятка повторов, и они располагаются в определенном порядке, конкретные TALE связываются с конкретными промоторными областями, то есть такое связывание является очень специфичным.

Например, TALE бактерий Xanthomonas euvesicatoria AvrBs3 имеет 17.5 повторов из 34-х аминокислотных остатков каждый и их комбинация такова, что этот эффектор связывается с промотором гена Bs3 в клетках растений перца. То есть такой белок узнает конкретную последовательность длиной восемнадцать нуклеотидов.

Еще одна важная особенность – первым нуклеотидом с 5-конца узнаваемой любым TALE последовательности (ее называют EBE от англ. effector-binding element – связывающий эффектор элемент промотора) обязательно должен быть тимидиловый нуклеотид. Считается, что взаимодействие с ДНК начинается с него, и из-за этого он называется заякоревающим нуклеотидом или якорем.

Вблизи С-конца эффекторов всегда находятся несколько (обычно три) коротких сигналов ядерной локализации (NLS от англ. nuclear localization signal) и самым последним участком С-концевого домена является фрагмент, который и запускает транскрипцию растительного гена после закрепления эффектора на промоторном участке.

Сам факт открытия таких белков и определения их структуры и функции оказался очень важным в плане выяснения взаимодействия патогенных бактерий с организмамихозяевами. Подобные белки-эффекторы в настоящее время описаны не только для бактерий рода Xanthomonas, но и для двух других видов: фитопатогена Ralstonia solanacearum и эндосимбионта фитопатогенного гриба Rhizopus microspores, который называется Burkholderia rhizoxinica.

В плане борьбы с болезнями сельскохозяйственных растений это открывает новые возможности для создания в дальнейшем устойчивых к этим возбудителям сельскохозяйственных растений за счет изменения тех генов растений или их промоторов, которые являются мишенями для TALE. Это направление признано в настоящее время одним из самых перспективных с учетом того, что развернуты широкомасштабные работы по секвенированию геномов многих видов сельскохозяйственных растений, в том числе и поражаемых бактериями, использующих TALE. Круг таких растений довольно широк: в него попадают бананы, бобы, соя, вигна, капуста во всех культивируемых вариантах, маниока, ячмень, рожь, пшеница, тритикале, рис, все цитрусовые, хлопок, перец, сливы, груши, нектарины, томаты, манго, грецкий орех.

Не менее важным является и создание на основе TAL-эффекторов специальных белков, уже нашедших применение в генетической инженерии очень разных организмов.

Внимание генных инженеров привлекли высокая специфичность связывания белков TALE с EBE и простота кодирования такой специфичности: один повтор – один нуклеотид. Это и стало основанием для конструирования на основе TALE нового поколения так называемых химерных нуклеаз.

Для этого использовали уже существовавшие генетические конструкции, разработанные для получения ZFNs (Zinc-finger nucleases). Фактически в таких плазмидах фрагмент, кодирующий «цинковые пальцы», попробовали заменить на кассеты повторов из генов, кодирующих TALE, комбинируя последовательность этих повторов в соответствии с расположением нуклеотидов в ДНК-мишенях. Оказалась, что полученные при экспрессии с таких конструкций химерные нуклеазы срабатывают аналогично ZFNs, только с более высокой точностью, поскольку здесь используется однобуквенный код (один повтор – один нуклеотид) (рис. 49).

Рис. 49. Схема работы TALENs

Апробирование таких конструкций в клетках прокариот и различных эукариотических организмов показало, что характерное для TALE распознавание последовательностей ДНК реализуется не только в растительных клетках, но и в клетках любого уровня организации. На бактериях и дрожжах это было проверено с использованием маркерных генов - проводилось разрезание in vivo последовательности гена lacZ в стандартных маркерных конструкциях и высев микроорганизмов на среды с X-gal и ИПТГ. В клетках различных видов животных - путем направленного нокаута ряда генов. Эффективность экспрессии TALENs-систем была показана в клетках круглых червей (нематода Caenorhabditis elegans), насекомых (дрозофила, сверчки, тутовый шелкопряд), амфибий (шпорцевая лягушка Xenopus tropicalis), рыб (медака и данио), различных млекопитающих (крупный рогатый скот, свинья, мышь, крыса, человек).

В течение нескольких лет были созданы системы полуавтоматизированной и полностью автоматизированной сборки нужных в каждом конкретном случае последовательностей повторов, основанные на поэтапном лигировании кодирующих повторы фрагментов ДНК (рис. 50).

–  –  –

Некоторые фирмы предлагают уже готовые конструкции, предназначенные для работы с определенными элементами генома тех или иных организмов. Одним из примеров такой продукции может быть производимый System Biosciences (SBI) набор для генетических манипуляций с клетками человека AAVS1 TALE Nuclease Kit.

Здесь следует остановиться еще на одном варианте применения химерных нуклеаз.

Они могут использоваться не только для получения инделей в выбранном гене-мишени (нокаута генов), но и для вставки целевых генов в геном. Основано такое применение на том, что клетки могут репарировать двунитевые разрывы в ДНК не только по пути негомологичного соединения концов, но и по пути гомологичной рекомбинации с сохранившей целостность копией данного гена.

Генно-инженерным способом можно, условно говоря, заставить клетки использовать для такой репарации искусственно созданную ДНК, содержащую участки гомологии с репарируемым геном, между которыми находится последовательность, предназначенная для встройки в геном. Для этого достаточно создать в ядре клетки определенную концентрацию таких молекул, и ферменты репарации будут использовать ее для залечивания повреждения. А это значит, что в результате такого процесса в хромосоме вместо разрезанного химерной нуклеазой гена окажется фрагмент, несущий вставку.

При работе с клетками человека были выявлены несколько локусов генома, вставки в которые чужеродных генов не приводят к заметным нарушениям основных физиологических процессов. Такие локусы условно называют «тихая гавань» (в англ. safe harbor). Одной их таких «тихих гаваней» и является локус AAVS1. Название этого локуса происходит от английской фразы adeno-assotiated virus integration site 1, что означает первый сайт интеграции аденоассоциированных вирусов. Для вставки в него целевой генетической информации и предлагается обсуждаемый набор.

Внесение двунитевого разрыва в AAVS1 обеспечивает пара плазмид из этого набора (рис. 51).

Рис. 51. Карты плазмид из AAVS1 TALE Nuclease Kit, предназначенные для экспрессии химерных нуклеаз (пояснения в тексте).

Репликон плазмид представлен фрагментом стандартной плазмиды E. coli из серии pUC, селективный маркер для поддержания в бактериях – ген устойчивости к канамицину KanR. представляет собой промотор цитомегаловируса, который CMV-фрагмент традиционно используется для экспрессии генов в большинстве типов клеток млекопитающих. Промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7 обеспечивает экспрессию в бактериальных клетках. Под этими промоторами в одной из плазмид находится последовательность левой TALEN (L1), во второй плазмиде правой TALEN (R1). В обеих плазмидах заканчиваются такие последовательности polyA-фрагментом из гена бычьего гормона роста (bGH polyA).

При совместном введении в клетки млекопитающих ДНК таких плазмид синтезируются две которые взаимодействуют с последовательностью TALEN, нуклеотидов в «тихой гавани» (рис. 52).

Для того чтобы в локус встроился целевой ген, авторы набора предлагают еще две плазмиды – так называемые донорные векторы для гомологичной рекомбинации (рис.53).

Обе эти плазмиды также являются производными pUC с бактериальным селективным геном устойчивости к ампициллину (AmpR). В обеих плазмидах имеется по две последовательности для гомологичной рекомбинации с ДНК локуса AAVS1-левая и правая (AAVS1HA-Left и AAVS1HA-Right).

Рис. 52. Рестрикция двух нитей ДНК в локусе AAVS1.

Рис. 53. Карты плазмид AAVS1 TALE Nuclease Kit, предназначенных для вставки генов путем гомологичной рекомбинации (пояснения в тексте).

В предназначенной для нагрузки целевым геном плазмиде расположен множественный сайт для клонирования целевых генов полилинкер (MCS) с уникальными последовательностями для шести рестриктаз. Вставляемый с помощью этих рестриктаз ген будет экспрессироваться с конститутивно действующего в клетках эукариот промотора гена фосфоглицераткиназы пекарских дрожжей, сайтом терминирования в этом случае будет bGH poly-A.

Далее следует классическая генетическая конструкция для отбора трансфецированных клеток млекопитающих, включающая химерный ген GFP+Puro под промотором гена фактора элонгации 1 (EF1) с терминатором из ДНК вируса обезьян SV40 (SV40 poly-A). Продукт этого искусственного гена, полученного за счет слияния генов пуромицин-N-ацетилтрансферазы из Streptomyces alboniger и гена зеленого флуоресцентного белка (GFP) из медузы Aquarea victoria, обеспечивает устойчивость клеток млекопитающих к пуромицину и одновременно позволяет контролировать наличие вставки по зеленому свечению из-за накопления в клетках GFP.

Поскольку два описанных выше элемента плазмиды находятся между AAVS1HALeft и AAVS1HA-Right, в результате гомологичной рекомбинации и целевой, и маркерный гены должны интегрироваться в локус AAVS1.

Вторая плазмида из этой пары донорных плазмид фактически является «нагруженным» вариантом уже описанной. В ней вместо MCS и стоящего перед ним промотора находится ген красного флуоресцирующего белка (RFP) под промотором цитомегаловируса (CMV). При введении ДНК такой плазмиды в клетки млекопитающих совместно с ДНК пары кодирующих TALENs плазмид (тройная котрансфекция) большинство трансфецированных клеток должно накапливать красный флюоресцирующий белок, что будет свидетельствовать о нормальном функционировании всего набора. Этот положительный контроль должен гарантировать также, что потребитель набора соблюдает все методические рекомендации в ходе проведения эксперимента.

В обеих плазмидах этой группы есть еще небольшой фрагмент Core insulator (основной изолятор), представляющий собой эукариотическую регуляторную последовательность, которая должна обеспечивать уменьшение влияния компонентов нуклеоплазмы на состояние и экспрессию введенных генетических конструкций.

Подобного рода наборы в настоящее время все шире используются в экспериментах по генной инженерии различных организмов, что существенно экономит время и упрощает пути к поставленным исследовательским и практическим целям.

Генно-инженерные системы на основе CRISPR/Cas9 Вторым положенным в основу новых генно-инженерных технологий стало ранее неизвестное биологическое явление, используемое клетками бактерий и архей для защиты от бактериофагов. С 60-х годов двадцатого века считалось, что клетки защищаются от вирусной атаки и вообще от проникновения чужеродных ДНК с помощью систем рестрикции-модификации. Но теперь стало понятно, что у бактерий имеется биологический механизм накопления информации об обитающих в окружающей среде вирусах, и эта информация передается в рядах поколений.

Основой для открытия этого явления стали постепенно накапливаемые в последней четверти 20-го века сведения о наличии в геномах некоторых бактерий коротких палиндромных повторов, разделенных небольшими участками ДНК различного нуклеотидного состава. Такие повторы, впервые описанные еще в 1987 году у E. coli, в дальнейшем получили название CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – собранные в кластеры промежуточные короткие палиндромные повторы), а расположенные между повторами участки стали называть спейсерами.

По мере того, как накапливались и обрабатывались данные о полногеномном секвенировании различных микроорганизмов, становилось понятно, что наличие таких CRISPR- кассет довольно распространенное явление, и они явно должны иметь какое-то функциональное значение. Оказалось, что рядом с такими кассетами в ДНК различных бактерий, как правило, располагаются сходные гены, которые кодируют белки с хеликазной и нуклеазной активностями. Такие гены и белки получили название cas от английской фразы CRISPR-associated (ассоциированные с CRISPR).

Никаких предположений о роли таких фрагментов генома прокариот не высказывалось до тех пор, пока достижения биоинформатики в 2005-ом году не позволили установить, что спейсерные участки в таких блоках представляют собой фрагменты ДНК различных бактериофагов. На основе этого группой биоинформатика Евгения Кунина было высказано предположение, что CRISPR-кассеты нужны бактериям как средство защиты от вирусов и теоретически предсказан механизм возможного действия такой системы.

В 2007-ом году удалось связать наличие конкретного спейсера в геноме Streptococcus thermophilus с устойчивостью к определенному бактериофагу, в геноме которого был обнаружен такой же фрагмент ДНК. Этот результат был получен в лаборатории производящей молочные продукты фирмы Danisco: отобрав устойчивые к конкретным вредящим производству бактериофагам бактерии, секвенировали ДНК таких мутантов и обнаружили новые спейсеры в CRISPR-кассетах. Последовательности этих спейсеров соотвествовали определенным участкам ДНК бактериофага. Тогда в CRISPRкассету чувствительного к вирусу штамма Streptococcus thermophilus генно-инженерным путем ввели фрагмент ДНК бактериофага и проверили этот генно-модифицированный штамм на устойчивость к такому фагу. Он оказался устойчивым к вирусу.

В течение нескольких последующих лет предположение Кунина и его коллег не только подтвердилось экспериментами в других лабораториях, но и был раскрыт механизм действия (рис. 54). Согласно существующим CRISPR/Cas-системы представлениям после первичного попадания вирусной ДНК в бактериальную клетку небольшой фрагмент такой ДНК при участии белков Сas1 и Сas2 встраивается в CRISPRкассету со стороны богатой АТ-парами лидерной последовательности, которая всегда находится рядом с кассетой. В пределах этой лидерной последовательности располагаются также промоторные элементы и сайты посадки регулирующих транскрипцию белков. Так в кассете появляется новый спейсерный участок. Причем, для того, чтобы он появился, надо, чтобы в ДНК вируса был так называемый PAM (Protospacer Adjacent Motif – фланкирующий протоспейсер мотив) – последовательность длиной 2пар нуклеотидов, от которой зависит превращение протоспейсера из ДНК вируса в спейсер в CRISPR-кассете.

Рис. 54. Механизм реализации защиты от вирусов с помощью CRISPR/Cas-системы.

После встройки нового спейсера с лидерной последовательности начинается транскрипция, охватывающая всю длину CRISPR-касеты, в результате чего появляется так называемая длинная полиспейсерная пре-CRISPR-РНК (сокращенно pre-crRNA).

Одновременно с этим должна произойти транскрипция cas-генов, и в клетке должен появиться определенный Cas-белок. У большинства бактерий таким белком оказывается эндонуклеаза Сas6. Она осуществляет процессинг pre-crRNA, в результате чего она распадается на участки, соответствующие спейсерам и нескольким нуклеотидам из повтора.

У некоторых бактерий, например Streptococcus pyogenes, количество Сas-белков уменьшено, и тогда на этапе процессинга работает Сas9. CRISPR/Cas-системы такого состава теперь классифицируются как CRISPR/Cas типа II-A. Но в этом случае в процессинге участвует кодируемая одним из cas-генов небольшая РНК, которая носит название tracrRNA (trans-activating crRNA – трансактивирующая crРНК). Такая РНК связывается с определенными фрагментами в последовательностях pre-crRNA, которые расположены в соответствующих повторам участках. Возникает двунитевая структура, с которой связывается Сas9-белок, что создает условия для того, чтобы РНКаза III отрезала от pre-crRNA таким образом зафиксированный фрагмент. По такой схеме вся pre-crRNA разделяется на функциональные crRNA. При этом формируются комплексы молекул Сas9 и конкретных crRNA.

Если рядом с таким комплексом оказывается двунитевая молекула ДНК, в которой есть комплементарный участок, заканчивающийся (фактически, crRNA PAM протоспейсер), то Сas9-белок проявляет свою эндонуклеазную активность. У этого белка есть два нуклеазных домена, один из которых находится на N-конце и называется RuvC, а второй располагается в средней части молекулы и называется HNH. Каждый из доменов разрезает только одну нить ДНК, что следует из того, что точечные замены аминокислот в пределах этих доменов приводят к превращению Сas9-белка в никирующую эндонуклеазу. Но обычный, немутантный, белок Сas9 разрезает узнанную за счет crRNA ДНК обеими своими нуклеазными доменами, спасая тем самым клетку от вируса.

Важно то, что таким образом бактерии не только используют свои CRISPR/Casсистемы в период контакта с вирусом, но и пополняют при каждом таком контакте свой, условно говоря, «генетический архив», в котором хранятся своеобразные «досье» на вирусов. Это позволяет некоторым авторам сравнивать такую систему защиты с имеющимся у высших животных механизмом формирования иммунологической памяти и создания тем самым активных форм приобретенного иммунитета, то есть называть CRISPR/Cas-системы «иммунной системой» бактерий.

В определенной степени такое сравнение уместно: если бактерия переносит вирусную атаку и пополняет при этом CRISPR-кассету новым спейсером, она при вторичном контакте с таким же вирусом ответит быстрым его уничтожением за счет CRISPR/Cas-системы. Аналогично переболевший инфекционным заболеванием организм млекопитающего оставляет после первичного иммунного ответа клетки памяти – специфические Т- и В-лимфоциты, и при вторичном инфицировании таким же патогеном их наличие предотвратит развитие болезни. Однако у высших животных такая память реализуется только в течение жизни каждого организма, иммунологическая память не наследуется, приобретенный иммунитет индивидуален. Другое дело у бактерий: их «иммунологическая память» передается дочерним клеткам в обязательном порядке и реализуется не на уровне организма, а на уровне популяции.

Но как бы не было интересно это явление из жизни бактерий само по себе, не менее важным оказалось его интерпретация в области генетической инженерии. Когда стал понятен механизм воздействия Сas9-белка на ДНК и осуществляемый им принцип узнавания мишени, стало понятно, что это природный эквивалент уже используемых человеком химерных нуклеаз ZFNs и TALENs. Только природный вариант лучше и проще: здесь срабатывает не довольно капризное белок-нуклеотидное узнавание, а простая всеми любимая комплементарность нуклеотидов! Причем надо только создать такую последовательность ДНК, которая была бы комплементарна ДНК-мишени и могла присоединяться к Сas9-нуклеазе. А дальше нуклеаза все сделает сама.

И генетические конструкции, способные проверить реальность такой схемы, быди созданы и опробованы в короткие сроки. В 2011 году было показано, что CRISPR/Casсистема из Streptococcus thermophilus функциональна в клетках Escherichia coli, и что при использовании Сas9 из Streptococcus pyogenes минимальным набором компонентов для воздействия на ДНК является tracrRNA, crRNA и собственно эндонуклеаза Сas9. Это и стало основанием для апробирования системы в клетках эукариот.

В 2012 году группы Дженифер Дудны (Doudna JA) и Эмануэль Шарпентье (Charpentier E) из Медицинского института университета Беркли (США) опубликовали в журнале Science статью, в которой сообщили об использовании CRISPR/Cas9-системы для программированного разрезания ДНК с помощью искусственно синтезированных аналогов crRNA. Заканчивалась эта статья предложением использовать данную систему для редактирования геномов. В течение следующих нескольких месяцев в лаборатории Фенга Жанга (Feng Zhang) в Институте Броуда (Массачусетский технологический институт, Кембридж, США) адаптировали систему CRISPR/Cas9 для использования в клетках эукариот и показали, что она работатет фактически в любых клетках, включая клетки человека.

Выяснилось также, что для эффективной доставки белка Cas9 в ядро ему не хватает сигналов ядерной локализации (NLS) и что для гарантированного связывания узнающей мишень короткой РНК с белком Cas9 лучше сразу объединять ее с tracrRNA. Для такого объединения синтезировали искусственно олигонкуклеотид, который разместили сразу за 3-концом crRNA и назвали «линкерная петля». Сразу же за линкерной петлей поставили последовательность, кодирующую tracrRNA, а первые 20 нуклеотидов от 5-конца crRNA оказались неважными для комплементарного взаимодействия с частью tracrRNA. Зато именно они и являются важными для распознавания простоспейсерного участка в ДНКмишени. То есть, меняя в этой структуре только эти первые 20 нуклеотидов можно направлять нуклеазу Cas9 на определенную мишень, что и послужило основанием для наименования таких РНК направляющими, или коротко РНК-гид. Объединяющая в себе направляющую на мишень РНК и tracrRNA последовательность получила название sgRNA (single guide RNA) или единая РНК-гид.

Все выше сказанное привело к появлению компактной генетической конструкции, содержащей две экспрессионные кассеты: одна для синтеза sgRNA, вторая – для синтеза матричной РНК модифицированного белка Cas9 (рис. 55).

Рис. 55. Схема генетической конструкции для редактирования генома в клетках млекопитающих.

hCas9 – адаптированная для лучшей экспрессии в клетках млекопитающих структурная последовательность белка Cas9 Streptococcus pyogenes. Темно-синим цветом выделена последовательность-гид, предназначенная для узнавания ДНК-мишени. U6 – промотор генов малых ядерных РНК, узнаваемый РНК-полимеразой III.

При введении такой конструкции в клетки эукариот в результате экспрессии обеих кассет появляются молекулы sgRNA и молекулы белка Cas9, которые объединяются и благодаря сигналам ядерной локализации в белке, направляются в ядро, где взаимодействуют с ДНК-мишенью (рис. 56).

Результатом такого взаимодействия является внесение в ДНК-мишень двунитевого разрыва в пределах указанной РНК-гидом последовательности. Как уже указывалось выше, наличие таких разрывов влечет за собой включение репарационных систем клетки, что может привести либо к появлению мутаций в мишени (при негомологичном соединении концов), либо создаются условия для замены фрагмента ДНК-мишени на целевую, выбранную исследователем последовательность (при реализации репарации по пути гомологичной рекомбинации). То есть возможности для направленного внесения в геном каких-либо изменений здесь практически такие же, как и при использовании TALENs. Но при этом сами генетические конструкции в системах редактирования геномов на основе CRISPR/Cas9 компактнее, а путь синтеза узнающей мишень последовательности значительно проще.

Рис. 56. Взаимодействие комплекса sgRNA-Cas9 с ДНК-мишенью.

Это открывает небывалые ранее возможности для исследования функций конкретных генов у организмов всех уровней организации, ведь нокаутировать можно практически любой ген, последовательность нуклеотидов в котором уже известна.

В сочетании с уже идущими в настоящее время программами секвенирования геномов организмов различных видов TALENs- и CRISPR/Cas9-системы могут обеспечить в ближайшие годы существенный прорыв в биологических исследованиях фундаментального толка. С другой стороны, наличие таких систем как раз и делает целесообразным и необходимым запуск новых проектов по секвенированию геномов, так как собственно секвенирование и анализ геномов перестают быть самоцелью. При этом открываются новые горизонты практического использования полученных в ходе таких фундаментальных исследований знаний.

С одной стороны, ожидаются новые успехи в уже хорошо зарекомендовавшей себя в практическом отношении генетической инженерии сельскохозяйственных растений.

В последние годы появляется все больше и больше публикаций, в которых сообщается о придании растениям новых хозяйственно-полезных признаков не за счет введения в геном новых генов, а за счет изменения активности собственных генов растений. Одним из примеров может быть получение растений риса, устойчивых к грибу Magnaporthe grisea – возбудителю перикуляриоза риса. В работе Fujun Wang et al. (2016) из университета Гуанси (КНР) была использована генетическая конструкция для направленного нокаута гена OsERF922, кодирующего один из факторов транскрипции, индуцируемых растительным гормоном этиленом (рис. 57).

–  –  –

В результате экспрессии такой конструкции в клетках растений риса был получен 21 мутант, из которых 6 оказались устойчивыми к поражению данным фитопатогенным грибом, и при этом по основным сельскохозяйственным признакам не отличались от растений исходного сорта. Важно отметить, что из первоначально полученных мутантов путем скрещиваний в двух последующих поколениях были отобраны дочерние растения, не несущие дополнительной генетической информации и наследующие мутантный аллель гена OsERF922 в гомозиготном состоянии.

Подобным путем, направленно индуцируя мутации в различных генах, получают растения устойчивые к стрессовым условиям, устойчивые к определенным бактериальным болезням и другие.

Огромные перспективы намечаются и в использовании редактирования генома в медицинском аспекте. В частности, с применением CRISPR/Cas9- и TALENs-систем на эмбриональных стволовых клетках млекопитающих и индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека смоделированы мутации в определенных генах, от которых может зависеть развитие как определенных наследственных заболеваний, так и протекание ряда инфекций. Использование таких мутантных клеток, с одной стороны, позволяет получить сведения о возможных путях диагностики и методах оказания помощи или лечения заболеваний, с другой стороны, разрабатывать подходы для возможной генотерапии.

По мнению специалистов в этой области медицины совмещение методик получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и методик редактирования генома позволит в будущем для каждого пациента создавать линии его собственных клеток с «отредактированными» генами. При введении таких клеток в организм не должно проявляться определяемое иммунной системой отторжение, и в случае замещения дефектных по тому или иному гену исходных клеток человека на свои же, но уже не имеющие дефекта клетки, ранее неизлечимая наследственная болезнь может быть полностью излечена.

Помимо манипуляций с изолированными клетками животных и человека ведется и разработка методов получения целостных организмов с «отредактированными» геномами.

В этом случае несущие CRISPR/Cas9-компоненты генетические конструкции вводят в клетки эмбрионов или в зиготы в составе соответствующих вирусных векторов, либо в зиготы доставляются матричные РНК белка Cas9 и соответствующие гид-РНК. Эти варианты введения системы редактирования позволяют получить нокауты выбранных генов в зародышевых клетках и далее получить животных с соответствующими фенотипами. Такие методики опробованы на модельных организмах разного уровня организации: насекомых (дрозофила), рыбах (данио), млекопитающих (мышь, крыса, обезьяна).

В частности, в 2014 году большой коллектив авторов из Китая в составе 28 человек опубликовал в журнале Cell работу, в которой оценивалась возможность получения одновременно нескольких направленных мутаций путем введения в оплодотворенную яйцеклетку макак (Macaca fascicularis) матричных РНК белка Cas9 и молекул гид-РНК, направляющих систему редактирования на два гена – Ppar- и Rag1, расположенные в Х-хромосоме и хромосоме 14 соответственно (рис. 58).

Всего было использовано 186 зигот, из которых 86 были успешно инъецированы и введены в матки 29 суррогатных матерей. У десяти из них была зафиксирована беременность: три самки вынашивали тройню, три – двойню, у остальных развивалось по одному плоду. По достижении срока рождения (155 суток) было осуществлено кесарево сечение самки, вынашивающей двойню, и путем секвенирования ДНК из тканей пуповины и плаценты проанализировано состояние целевых генов Ppar- и Rag1 у двух первых родившихся детенышей, условно обозначенных А и В (рис 59).

Рис. 58. Условная схема получения приматов Macaca fascicularis с направленно отредактированным геномом (из статьи Yuyu Niu et al., Cell, 2014, 156, 836-843).

Рис. 59. Результаты секвенирования целевых участков ДНК приматов Macaca fascicularis, родившихся после процедуры редактирования генома на уровне одноклеточного эмбриона (из статьи Yuyu Niu et al., Cell, 2014, 156, 836-843).



Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Похожие работы:

«ISSN 2079-5459 (print) СЕРІЯ НОВІ РІШЕННЯ В СУЧАСНИХ ТЕХНОЛОГІЯХ ISSN 2413-4295 (online) УДК 661.872+544.6+661.4 doi:10.20998/2413-4295.2017.07.24 НОВЫЕ РЕШЕНИЯ В ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРРАТОВ(VI) С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОДИФИЦИРОВАННЫХ S...»

«Белорусский национальный технический университет Тульский государственный университет Донецкий национальный технический университет 9-я международная конференция по проблемам горной промышленности, строительства и энергетики СОЦИАЛЬНО-ЭКОНОМИЧЕСКИЕ И ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕ...»

«РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ (19) (11) (13) RU 2 577 068 C1 (51) МПК A23B 4/06 (2006.01) ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ (12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ 2014148815/13, 03.12.2014 (21)(22) Заявка: (72) Автор(ы): Ким Игорь Николаевич (RU), (24) Дата...»

«Федеральный арбитражный суд Дальневосточного округа Постановление № Ф03-5188/2011 03.04.2012 Резолютивная часть постановления объявлена 27 марта 2012 года. Полный текст постановления изготовлен 03 апреля 2012 года. Федеральный арбитражный суд Дальневосточного округа в составе: Председательствующего: О....»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ УРАЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЛЕСОТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ Кафедра физико-химической технологии защиты биосферы Е.Н. Тюльканов ПРОВЕДЕНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО АУДИТА НА...»

«Министерство здравоохранения Российской Федерации Федеральное медико-биологическое агентство ФГБУ НИИДИ ФМБА России Северо-Западное отделение РАМН Комитет по здравоохранению Правительства Санкт-Петербурга Комитет по науке и вы...»

«УСТИНОВА АЛИСА СЕРГЕЕВНА РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ СБРАЖИВАНИЯ ВЫСОКОКОНЦЕНТРИРОВАННОГО СУСЛА ИЗ ЯЧМЕНЯ Специальность 05.18.07 – Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Санкт-Петербург Работа выполнена в ГОУ ВПО "Санкт-Петербургский национальный исследовател...»

«БІОГЕОЦЕНОЛОГІЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ УДК 502.1 (477) © А. В. Боговин ТИПЫ КАТЕГОРИЙ БИОРАЗНООБРАЗИЯ В УСЛОВИЯХ АНТРОПОГЕННОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ Национальный научный центр "Институт земледели...»

«30.07.-03.08.12 Подготовлено Департаментом маркетинга ЗАО "Колакс-М" Оглавление 1. МСХ РФ..3 2. КОЛАКС..4 3. Регионы..5-7 4. Мероприятия..8 5. Технологии..9 6. Новое (фермы, производства, оборудование и т.д.).10 7. Конкурсы..11 8. Зарубежье..12 9. Интересно..13 10. ВТО..14 МСХ РФ Дмитрий Медведев подписал распоряжение о...»

«ВАЗОРАТИ МАОРИФ ВА ИЛМИ ЉУМЊУРИИ ТОЉИКИСТОН МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН ДОНИШГОЊИ ДАВЛАТИИ ХУЉАНД БА НОМИ АКАДЕМИК БОБОЉОН FАФУРОВ ХУДЖАНДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ АКАДЕМИКА БАБАДЖАНА ГАФУРОВА НОМАИ ДОНИШГОЊ силсилаи илмњои табиатшиносї ва иќтисодї УЧЁНЫЕ ЗАПИСКИ серия естественные и экономические науки №1 (40)...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФГБОУ ВО "СГУ имени Н.Г. Чернышевского" Биологический факультет Рабочая программа дисциплины Биология индивидуального развития Направление подготовки 44.03.01 Педагогическое образование Профиль подготовки Биология Квалификация выпускника Бакалавр Форма обучения...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ИННОВАЦИОННЫЙ ЕВРАЗИЙСКИЙ УНИВЕСРСИТЕТ МАГИСТРАТУРА Кафедра "Химия и экология" МОРОЗОВА КСЕНИЯ ВИКТОРОВНА ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ИЗВЛЕЧЕНИЯ ЖЕЛЕЗИСТОЙ СОСТАВЛЯЮЩЕЙ ПРИ КОМПЛЕКСНОЙ ПЕРЕРАБОТКЕ БОКСИТОВ НА...»

«Тренинг нарушенных функций мышц миографическим методом биологической обратной связи (БОС по ЭМГ) Методическое руководство к портативному носимому прибору для контроля инъекций, проведения сеансов БОС-...»

«1. ТРЕБОВАНИЯ К ГОСУДАРСТВЕННОМУ ЭКЗАМЕНУ ДЛЯ СТУДЕНТОВ, ОБУЧАЮЩИХСЯ ПО НАПРАВЛЕНИЮ ПОДГОТОВКИ 38.03.02. "МЕНЕДЖМЕНТ"1.1. Нормативно правовая база В соответствии с Федеральным Законом Российской Федерации от 21.12.2012 № 273-ФЗ "Об образовании в РФ" (вступил в силу с 1.09.2013 года), Федеральным Законом Российской Федерации...»

«Министерство экологии и природных ресурсов Нижегородской области Нижегородское отделение Союза охраны птиц России Экологический центр "Дронт" Нижегородский государственный педагогический университет им. Козьмы Мин...»

«Газификация транспорта в Украине: экономические аспекты. Терехов Е. Н. Сумский государственный университет Газификация транспорта является одним из возможных путей решения эколого-экономических проблем...»

«Примечания к финансовой отчетности 1 июля 2007 года АО "Илийский Картонно-Бумажный Комбинат" (Суммы указаны в тенге) 1. ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ АО “Илийский Картонно-Бумажный Комбинат” зарегистрировано в органах юстиции 29.07.2005 г. (дата первичной...»

«Институт экологии и природопользования Миссия и цели Института Миссия нашего Института – подготовка конкурентоспособных кадров, востребованных не только в Республике Татарстан и в России, но и за рубежом. Получение образования в нашем Институте – залог воспроизводства научного потенциала России. Наша цель к...»

«Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной экологии. 2010. – Т. 19, № 2. – С. 122-150. УДК 582.29 ФЛОРИСТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ОСОБО ЦЕННОГО КРАСНОСАМАРСКОГО ЛЕСНОГО МАССИВА САМАРСКОЙ ОБЛАСТИ: II. ЛИШАЙНИКИ © 2010 Е.С. Корчиков* Самарский государственный университет, г. Самара (Россия) П...»

«23 РОЗДІЛ 2. ЗООЛОГІЯ ТА ЕКОЛОГІЯ ТВАРИН УДК 597. 2/5: 577.112(262.5) СЕЗОННЫЕ КОЛЕБАНИЯ УРОВНЯ ЭНДОГЕННОЙ ИНТОКСИКАЦИИ В КРОВИ МОРСКОГО ЕРША Дорохова И. И., ведущий инженер Институт биологии южных морей НАН У...»

«МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ ГУ "РЕСПУБЛИКАНСКИЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР РАДИАЦИОННОЙ МЕДИЦИНЫ И ЭКОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА" Ю.И. Ярец БИОХИМИЧЕСКИЕ ТЕСТЫ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ Часть II Практическое пособие для врачей Гомель, ГУ "РНПЦ РМиЭЧ",...»

«Положение о взаимодействии аварийно спасательных служб министерств, ведомств и организаций на море и водных бассейнах России (утв. МЧС РФ 21.06.1995, Минобороны РФ 18.04.1995, Минтрансом РФ 29.03.1995, Минтопэнерго РФ 15.03.1995, МВД РФ 31.03.1995, Минприроды РФ 25.01.1995, Росгидрометом 24.01.1995, Минздравмедпромом...»

«вестник тюменского государственного университета. Экология и природопользование. 2016. том 2. № 1. 43-60 Ирина викторовна ФИЛИмоНова1 Леонтий викторович ЭдЕр2 алена ярославовна дяКуН3 тлеш муратович мамахатов4 Удк 553.041 КомпЛЕКСНый аНаЛИЗ СоврЕмЕННого СоСтояНИя НЕФтЕгаЗового КомпЛЕКСа воСточНой СИбИрИ И...»










 
2017 www.book.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.