WWW.BOOK.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные ресурсы
 
s

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

«Трансгенные эукариотические организмы курс лекций Минск БГУ Александр Георгиевич Песнякевич, кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии. Курс лекций разработан для биологического ...»

-- [ Страница 2 ] --

Еще одним вариантом повышения эффективности трансформации является использование липосом. Липосомами называют везикулы, которые можно получить суспендируя в растворе фосфолипидные молекулы по особой методике. Если в таком растворе присутствуют молекулы ДНК или РНК, они оказываются внутри везикул. При совмещении протопластов растительных клеток и липосом в буферных растворах, содержащих способствующие слиянию мембран и эндоцитозу (полиэтиленгликоль, поливиниловый спирт и т.п.) вещества, высокую концентрацию ионов кальция и имеющих щелочные значения рН, происходит ассоциация липосом с поверхностью мембраны протопластов и поглощение их путем эндоцитоза. В цитоплазме протопласта фосфолипидная оболочка со временем распадается, освобождая молекулы нуклеиновой кислоты. Недостатком метода считаются высокие требования к протопластированию – протопласты не должны иметь на поверхности даже остатков клеточной стенки. Кроме того, получение липосом несколько усложняет методику в целом, но это компенсируется снятием токсического эффекта высоких концентраций ДНК и защитой ДНК от эндонуклеаз растительной клетки.

Близким по сути к липосомному методу является метод слияния протопластов растительных клеток и сферопластов бактерий. Бактериальные клетки можно частично лишить твердой клеточной стенки путем обработки их соответствующими ферментами. Эти структуры называют сферо-, а не протопластами из-за того, что до сих пор не удается найти способы полного удаления клеточной стенки бактерий при сохранении их жизнеспособности.

Однако, несмотря на сохранение элементов клеточной стенки, такие клетки имеют характерную для истинных протопластов сферическую форму, и, самое главное, могут сливаться друг с другом или с протопластами других клеток в растворах веществ, способствующих ассоциации биологических мембран – полиэтиленгликоля, поливинилового спирта или других. Для реализации такого метода необходимо получение сферопластов из бактериальной культуры, в клетках которой содержится большое число копий плазмиды, несущей соответствующую генетическую конструкцию. Показано, что лабораторные штаммы Е. coli пригодны для превращения их в сферопласты, и их можно использовать для слияния с протопластами растительных клеток.

По сути своей два последних метода доставки ДНК в растительные клетки являются не столько химическими, сколько физическими, но чисто физическим методом повышения эффективности проникновения ДНК в растительные протопласты следует, вероятно, считать метод электропорации. Он основан на том, что под действием электрического тока молекулы в биологических мембранах меняют свое положение.

После снятия воздействия молекулы липидного бислоя и связанные с ними белковые молекулы возвращаются в исходное положение. Проводимые на клетках животных эксперименты, показали, что при правильно подобранных силе тока, напряжении и времени воздействия в мембранах клеток возникают кратковременно существующие поры, через которые присутствующие в высокой концентрации молекулы ДНК успевают проникнуть в цитоплазму. При таком воздействии значительная часть клеток гибнет, но среди сохранивших жизнеспособность более 50% клеток оказываются трансформированными. В дальнейшем такой метод введения ДНК был успешно опробован на бактериальных клетках и в конечном итоге адаптирован для манипуляций с растительными протопластами.

Оптимальными для электропорирования протопластов растений оказались два подхода: используют либо высоковольтный импульс малой длительности (например, для протопластов клеток табака это напряжение 1500 В/см в течение 10 микросекунд), либо низковольтный импульс гораздо большей длительности (350 В/см в течение 54 миллисекунд). Число и частота импульсов могут различаться, но если напряжение и длительность импульса оптимизированы, достаточно одного импульса. Проводить обработку электрическим полем можно в среде для культивирования протопластов или, при необходимости, оптимизировать концентрацию солей в ней для электропорации.





Протопласты смешивают с раствором ДНК и прогревают при температуре 45°С на водяной бане в течение 5 минут, затем охлаждают на льду и выдерживают при комнатной температуре 10 мин. Затем добавляют раствор полиэтиленгликоля 6000 в рекомендованных концентрациях, аккуратно перемешивают и переносят в кювету для электропорации. Плотность суспензии должна быть порядка 106 протопластов/мл. Кювету помещают в прибор для электропорации, и после воздействия электрического поля протопласты переносят на среду для культивирования и инкубируют в течение 36-48 часов в темноте для рекомбинации введенной и реципиентной ДНК и выражения признака антибиотикорезистентности. Затем переносят клетки на селективную среду, обеспечивающую восстановление клеточной стенки и далее регенерации растения из формирующихся каллусов.

В настоящее время при использовании оптимизированных методик протопластирования, электропорации и регенерации растений из протопластов эффективность введения ДНК этим методом может достигать десятков процентов от числа выживших после электропорации протопластов.

Еще один чисто физический способ доставки ДНК в клетку – это бомбардировка микрочастицами (биобаллистика или сокращенно биолистика). В качестве микрочастиц используют сферические частицы благородных металлов – золота или вольфрама, поскольку они обладают необходимой массой и твердостью и при этом не являются токсичными. ДНК на частицах диаметром от 0,4 до 1,2 мкм закрепляют путем обработки растворами нуклеиновой кислоты и или спермидина, или CaCl2, полиэтиленгликоля. С помощью специальных приборов покрытые ДНК частицы разгоняют до скорости 300 – 600 м/с и направляют поток таких частиц на изолированные клетки, фрагменты растения или целостное растение. Для создания потока летящих с указанной скоростью частиц используют либо газы, образующиеся при сгорании пороха, либо сжатый воздух или гелий. Частицы пробивают клеточную стенку и мембраны растительной клетки. При этом их скорость и размеры таковы, что клетки практически не повреждаются. Доставленная в клетки ДНК частично переходит в свободное состояние и может взаимодействовать с молекулами ДНК в ядре, митохондриях или пластидах, то есть такой метод введения генов может быть использован не только для введения в пластидный геном.

Метод бомбардировки микрочастицами позволяет трансформировать растения практически любых видов. Но при этом известно, что происходит она с невысокой частотой, а интеграция и экспрессия чужеродных генов может зависеть от вектора, используемого для их введения. Например, частота трансформации повышается, если используется линейная, а не кольцевая ДНК. Кроме того, при бомбардировке микрочастицами высокомолекулярные плазмиды (более т.п.н.) могут фрагментироваться, поэтому уровень экспрессии чужеродных генов окажется ниже, чем в случае плазмид меньшего размера.

К физическим методам следует отнести и метод микроинъекций. Он успешно применяется для доставки чужеродной генетической информации в клетки животных и заключается в непосредственном введении растворов ДНК в клетку или ее ядро с помощью полых стеклянных микроигл. Процесс введения микроиглы в зафиксированную на твердой поверхности отдельную клетку осуществляется под визуальным контролем на специальном микроскопе, оборудованном микроманипулятором. После проникновения кончика иглы в объект, с помощью специальной гидравлической системы через иглу подается от 1 до 5 пиколитров раствора ДНК с концентрацией от 0,1 до 1,0 мкг/мл.

Применение этого метода для генно-инженерных манипуляциий с растениями сдерживалось отсутствием методик закрепления растительных клеток или их протопластов на поверхности стекла. С разработкой методик иммобилизации с помощью тонких пленок поли-L-лизина или слоя легкоплавкой агарозы микроинъекции стали применимы в генетической инженерии растений, но не получают широкого распространения из-за сложности используемого оборудования и трудоемкости. Важной является и квалификация оператора, непосредственно осуществляющего микроинъекции, поскольку от точности введения и удаления иглы существенно зависит выживаемость клеток.

Получение трансгенных растений для сельскохозяйственного использования Развитие генетической инженерии в целом и генетической инженерии растений в частности открыло небывалые перспективы для успешной селекционной работы.

Основной задачей селекционеров всегда было создание таких сортов, которые бы при минимальных затратах на выращивание давали максимально большие урожаи.

Теоретически для решения этой задачи можно либо максимально повышать продуктивность растений, либо уменьшать затраты.

Продуктивность растений базируется на потреблении минеральных веществ из окружающей среды и эффективности процесса потребления энергии – фотосинтеза.

Формирование и функционирование проводящих систем и фотосинтетического аппарата высших растений сбалансировано и определяется сложно регулируемым взаимодействием множества генов. Поэтому изменить здесь что-либо путем введения новой генетической информации на данном этапе развития науки не представляется возможным. Например, для придания растениям важного с хозяйственной точки зрения свойства напрямую усваивать азот атмосферы, как это делают азотфиксирующие прокариотические организмы, необходимо внедрить в хорошо сбалансированный растительный геном как минимум несколько десятков генов собственно азотфиксациии и каким-либо образом обеспечить условия их оптимального функционирования в растительном организме.

Попытаться хотя бы частично решить проблему азотного питания сельскохозяйственных растений, не относящихся к семейству Бобовые, путем придания им способности вступать в мутуалистический симбиоз с азотфиксирующими микроорганизмами, такими, как Rhizobium или Frankia кажется более вероятным. Однако и здесь пока еще недостаточно сведений о генах растений сем. Бобовые, от продуктов которых зависит способность вступать в такой симбиоз.

Такая же картина наблюдается и с системой фотосинтеза. Несмотря на то, что к 2006 году полностью секвенировано 58 геномов пластид, среди которых 40 – это геномы высших растений, надежд на создание в ближайшее время сверхпродуктивных сельскохозяйственных растений на основе изменения их фотосинтетического аппарата пока немного.

Исходя из этого, современная генетическая инженерия растений ориентирована на придание растениям сельскохозяйственно важных признаков, которые бы уменьшали затраты на возделывание культур и определялись бы одним или несколькими генами. К числу таких хозяйственно-полезных признаков относятся устойчивость к гербицидам и устойчивость к насекомым-вредителям.

Трансгенные растения, устойчивые к гербицидам Гербициды – фитотоксические вещества, без применения которых современное сельское хозяйство обойтись не в состоянии и их производство неуклонно расширяется. К сожалению, большинство из практически применяемых гербицидов, а их сейчас насчитывается более 100, могут накапливаться в почвах, попадать в водоемы, а некоторые из них в ходе частичной деградации превращаются в еще более токсичные вещества.

Многие из этих гербицидов являются специфичными по отношению к конкретным видам или группам видов сорных растений, и это дает возможность применять их во время активной вегетации выращиваемой культуры. Но их использование влечет за собой неоднократные обработки разными гербицидами, что удорожает производство и способствует большему загрязнению окружающей среды.

Более экономичными и экологичными являются гербициды широкого спектра действия, одинаково хорошо подавляющие сорные растения различных видов, принадлежащие к обоим классам покрытосеменных растений. Их использование дает возможность одной обработкой предотвращать развитие всего комплекса сорной растительности, имеющейся в данном агроценозе. Однако обработку такими гербицидами приходится проводить еще до появления всходов выращиваемой культуры, а в период ее активной вегетации либо применять их точечно, что удорожает производство, либо дополнительно использовать разные гербициды узкого спектра действия со всеми вытекающими отсюда последствиями.

С развитием генетической инженерии растений появилась возможность преодолеть этот недостаток гербицидов широкого спектра действия, придавая культурным растениям устойчивость (толерантность) к этим веществам. Для решения этой задачи были проведены дополнительные исследования механизмов действия гербицидов этой группы и установлены мишени для них в растительной клетке. По механизму действия они делятся на: 1) ингибиторы процесса фотосинтеза; 2) ингибиторы биосинтеза ароматических аминокислот; 3) ингибиторы биосинтеза разветвленных аминокислот.

Наиболее широко применяемыми ингибиторами фотосинтеза являются симметричные S-триазины (атразин, симазин) и производные фенилмочевины (диурон).

Эти вещества способны подавлять процесс нециклического фотофосфорилирования, присоединяясь к тиллакоидным мембранам и блокируя перенос электронов к вторичному акцептору электронов белку Q. Этот белок кодируется локализованным в пластидной ДНК геном psbA. Сравнение гена psbA из обычных растений и из устойчивого к атразину сорного растения Amaranthus hybridus (такие растения были обнаружены на полях, где атразин применялся более десятка лет) показало, что мутантные варианты отличаются либо заменой остатка серина в 228 положении на остаток глицина, либо заменой валина в 219 положении на изолейцин, либо фенилаланина-225 на тирозин.

Несмотря на то, что такой мутантный белок имел несколько сниженную по сравнению с белком дикого типа биологическую активность, кодирующий его ген был объединен с последовательностью из гена малой субъединицы рибулозобифосфаткарбоксилазы гороха (rbcS), кодирующей транзитный пептид, и эта конструкция под промотором нопалинсинтазы была введена в клетки табака с помощью агробактериальной векторной системы.

Полученное трансгенное растение табака было резистентно к атразину. Эта работа, выполненная в 1984 году, была первой работой, показавшей возможность введением одного гена придать растению хозяйственно полезный признак.

Далее было показано, что источниками генов, придающих устойчивость к гербициду, не обязательно должны быть высшие растения. Путем культивирования на средах с гербицидом были отобраны устойчивые к диурону и атразину мутанты цианобактерии Anacystis nidulans и такие же мутанты одноклеточной эукариотической водоросли Chlamidomonas reinhardii. Из них были отклонированы гены psbA и также показана возможность их экспрессии в клетках растений табака.

Среди ингибиторов биосинтеза ароматических аминокислот наиболее широко применяемым является глифосат (N-фосфонометилглицин), в огромных масштабах производимый фирмой «Monsanto» под коммерческим названием Раундап. Это вещество подавляет активность 5-енолпирувил-3-фосфатсинтетазы - одного из ключевых ферментов пути биосинтеза ароматических аминокислот в хлоропластах. В 1980-х годах еще не были обнаружены устойчивые к глифосату высшие растения, но было известно, что хлоропластный путь биосинтеза аминокислот по сути своей является прокариотическим.

Поэтому как источники генов устойчивости к глифосату были использованы бактерии.

При изучении мутантов бактерий, устойчивых к глифосату, было установлено, что устойчивость может определяться как сверхпродукцией фермента (регуляторные мутанты, у которых сам фермент не изменен), так и мутациями в структурной части гена aroA (так называется бактериальный ген, кодирующий 5-енолпирувил-3фосфатсинтетазу). Для переноса в растения в разных лабораториях и в разные годы использовали гены с изменениями в структурной части из устойчивых к глифосату мутантов E. coli, Salmonella typhimurium и Agrobacterium tumefaciens штамм CP4.

Были опробованыразличные генетические конструкции с бактериальными генами aroA. Одним из вариантов было объединение мутантной последовательности aroA с 5концевым фрагментом гена малой субъединицы рибулозобифосфаткарбоксилазы rbcS из растений гороха. Этот фрагмент содержит промоторную область и последовательность лидерного пептида, обеспечивающего транспортировку прикрепленного к нему белка в хлоропласты. В других подобных конструкциях использовались не промоторы гена rbcS, а другие конститутивно работающие сильные промоторы (Pnos, P35S RNACaMV), но обязательно в сочетании с последовательностями транзитных пептидов. Все эти конструкции вводились в хромосомную ДНК растений с помощью агробактериальных векторных систем. С развитием методики введения генов в пластидный геном были испробованы генетические конструкции для экспрессии гена aroA непосредственно в хлоропластах, в которых использовались соответствующие промоторы и отсутствовали последовательности транзитных пептидов. Практически на уровне сельского хозяйства реализовались конструкции с бактериальными aroA-генами в хромосомной ДНК. Ряд широко используемых со второй половины 1990-х годов коммерческих сортов сои и сахарной свеклы сконструированы на этой основе.

Гербициды хлорсульфурон и сульфометуронметил (производные сульфонилмочевины) - ингибиторы биосинтеза синтеза разветвленных аминокислот (изолейцина и валина). Они также в огромных масштабах производятся фирмой DuPont.

Сходным действием обладают и имидазолиновые гербициды. Мишенью для всех гербицидов с таким механизмом действия является изофермент II ацетолактатсинтетазы (ALS II) – первый фермент пути биосинтеза изолейцина и валина. У растений кодирующие ALS II гены имеют хромосомную локализацию, но продукт их трансляции имеет транзитный пептид для транспортировки в хлоропласты.

Для создания растений, устойчивых к гербицидам этой группы, путем селекции на средах с этими веществами были получены мутанты бактерий (Salmonella typhimurium), дрожжей (Sacharomyces cerevisiae), а также клеточные линии Nicotiana tabacum и Arabidopsis thaliana. В допущенных до коммерческого использования сортах нашли применение гены из арабидопсиса (устойчивый к имидазолинам рис) и табака (одна из линий трансгенной кукурузы).

Рассмотренные примеры является реализацией одного из стратегических направлений в создании гербицидоустойчивых растений. Во всех этих случаях методами генетической инженерии в растениях заменяли чувствительный к гербициду белок (мишень для гербицида) на устойчивый. Еще одна возможность сделать растение резистентным – это придать ему способность разрушать или химически модифицировать поступающие в клетку молекулы гербицида так, чтобы они не могли оказывать свое губительное действие. Это второе стратегическое направление кажется более предпочтительным с точки зрения уменьшения засоренности почв гербицидами, но для его реализации необходим поиск особых специфических генов. Успешно реализовать такой подход в создании резистентности удалось в отношении фосфинотрициновых гербицидов.

Первым гербицидом этой группы был биалофос - вещество, продуцируемое стрептомицетами двух видов: Streptomyces hygroscopicus и Streptomyces viridochromogenes.

Это соединение представляет собой трипептид, состоящий из двух остатков L-аланина и остатка фосфинотрицина – аналога глютаминовой кислоты. При попадании биалофоса в растительную клетку под действием внутриклеточных пептидаз происходит его распад и освобождается фосфинотрицин, который необратимо инактивирует ключевой фермент в ассимиляции аммония – глютаминсинтетазу. В настоящее время в качестве действующего вещества ряда гербицидов используется химически синтезированный аналог фосфинотрицина – глюфозинат аммония.

Источниками генов резистентности к этой группе гербицидов стали продуценты биалофоса. Эти стрептомицеты не чувствительны к фосфинотрицину, поскольку образуют фермент фосфинотрицинацетилтрансферазу, снимающий токсическое действие фосфинотрицина путем его ацетилирования. У Streptomyces hygroscorpius кодирующий такой фермент ген получил название bar, а у Streptomyces viridochromogenes – pat. В получении коммерческих сортов трансгенных растений были использованы оба гена.

Линии гербицидоустойчивых сортов рапса, турнепса, сахарной свеклы, сои, кукурузы, цикория содержат ген bar, а трансгенный рис – ген pat.

По такой стратегии – перенос в растение генов, дезактивирующих гербицид, получены и широко используются глифосатустойчивые сорта кукурузы. Для их создания использован ген глифосатоксидоредуктазы из близких к псевдомонадам бактерий Ochrobactrum anthropi.

Новые трансгенные сорта создаются преимущественно в рамках этой стратегии.

Найдены пути создания растений, устойчивых к феноксикарбоксильным кислотам (гербициды ауксиноподобного механизма действия 2,4-D и 2,4,5-T). В этом случае в генетических конструкциях используется ген tfdA из бактерий Alcaligenes eutrophus, кодирующий диоксигеназу, способную разрушать эти соединения. Против оксиниловых гербицидов, являющихся ингибиторами фотосистемы II, в растения хлопка ввели ген нитрилазы из бактерий рода Klebsiella – под действием этого фермента бромоксинил и иоксинил утрачивают свою токсичность. Для придания растениям устойчивости к цианамидам может быть применен ген цианамидгидратазы из гриба Myrothecium verrucaria, которая превращает гербицид в мочевину. Устойчивость табака к далапону (дихлорпропионату натрия) удалось создать, использовав ген дегалогеназы из бактерий Pseudomonas putida. Отщепление атомов хлора превращает гербицид в пропионовую кислоту.

В настоящее время устойчивые к гербицидам растениями занимают 80% посевных площадей, на которых выращивают трансгенные растения. Около 10% среди них составляют сорта, одновременно устойчивые к гербицидам и к насекомым-вредителям.

Трансгенные растения, устойчивые к насекомым-вредителям Недостатки химических инсектицидов (пестицидов, применяемых для борьбы с насекомыми) – высокая токсичность, низкая избирательность действия, медленное разложение в почвах – в настоящее время известны всем. Их широкое применение во второй половине 20-го века привело к ряду экологических проблем, но отказаться от них стремительно размножающееся человечество было не в состоянии. Разработка и частичное применение биологических средств защиты сельскохозяйственных культур на основе вирусов и бактерий не снимало остроты вопроса. Дилемма – сохранить природу или умереть от голода – казалась не разрешимой. Но с развитием генетической инженерии появилась реальная надежда на выход из этого тупика.

Основанием для этого стало изучение бактерий вида Bacillus thuringiensis, представители которого могут вызывать гибель различных видов насекомых. Несмотря на то, что различные подвиды этого вида поражают различные виды насекомых, у всех у них цидное действие связано со способностью на стадии споруляции синтезировать и накапливать в цитоплазме особый белок, который располагается в виде кристаллов вблизи формирующейся споры. Изучение кристаллических белков различных подвидов Bacillus thuringiensis показало, что все они представляют собой так называемые протоксины, которые под действием протеаз пищеварительного сока насекомых превращаются в активный токсин. Такой токсин специфически связывается с рецепторами клеток эндотелия кишечника и формирует в них поры, что приводит к нарушению клеточного гомеостаза и в конечном итоге к гибели клеток. Далее патоген проникает через поврежденный эндотелий и, используя другие факторы патогенности, заселяет организм насекомого, приводя его к гибели.

При изучении вызываемого Bacillus thuringiensis патогенеза было установлено, что даже без участия остальных факторов патогенности токсин из параспоральных кристаллов может приводить насекомое к гибели. Выяснилось также, что по структуре протоксины представляют собой одноцепочечные белки, кодируемые одним геном. Это и стало основанием для реализации проектов по созданию растений, устойчивых к насекомымвредителям.

Гены кристаллических белков Bacillus thuringiensis клонировали в различных лабораториях, и это привело к появлению целого ряда синонимов, применяемых ныне для называния этой группы белков. Помимо названия кристаллический белок, которое использовано в наименовании кодирующего его гена, используют на равных термины энтомотоксин, инсектицидный токсин, кристаллический протеин, дельта-токсин, токсин, Bt-токсин, Bt-протеин, ВТ-протеин. Экспрессия клонированных генов в системе E. coli позволила выделить и хорошо охарактеризовать целый ряд энтомотоксинов, характерных для различных подвидов Bacillus thuringiensis (табл. 3).

Проверка влияния энтомотоксина на организм млекопитающих путем кормления в течение 15 дней белых мышей пищей, содержащей 5 граммов чистого энтомотоксина на 1 кг веса подопытных животных, показала полное отсутствие каких-либо физиологических изменений у подопытных животных.

Было установлено, что чистый энтомотоксин в желудочном соке млекопитающих полностью переваривается за 10 минут, а воздействие температуры в ходе обычной кулинарной обработки полностью денатурирует энтомотоксин. Эти факты указывали на то, что работы по получению энтомоустойчивых растений можно проводить на всех сельскохозяйственных растениях без ограничений.

При исследовании различий между энтомотоксинами из разных подвидов выяснилось, что собственно инсектицидная активность большинства энтомотоксинов связана с N-концевыми участками. Например, у протоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki из 1156 аминокислотных остатков для максимального токсического действия достаточно 646 аминокислотных остатков, начиная от N-конца. Исходя из этого, было создано несколько укороченных вариантов различных cry-генов, причем токсичность экспрессированных с них укороченных белков была выше, чем у исходных форм. Именно такие укороченные варианты и использовали в генетических конструкциях, вводимых в растения.

Повысить инсектицидные качества трансгенных растений оказалось возможным и с помощью модификации последовательностей укороченных генов энтомотоксинов. В частности, заменили кодоны, способствующие образованию вторичной структуры РНК и участки, способные приводить к появлению сайтов полиаденилирования. Такой химически модифицированный ген имел 49% Г-Ц пар (дикий тип – 37%) и только 78,9% гомологии с геном дикого типа, но зато продукция токсина в клетках растений с таким геном была в 100 раз выше, чем у растений, трансформированных геном дикого типа. Еще больше удается повысить выход белка (до 1% от всех белков листа) путем постановки укороченного гена токсина под промотор гена малой субъединицы РБФК, а также посредством введения гена токсина в ДНК хлоропластов.

Использование хлоропластного, а не ядерного генома считается в целом предпочтительнее, поскольку транскрипция и трансляция в хлоропластах идет по прокариотическому типу и можно не изменять последовательность гена, подстраивая его под эукариотический тип. Кроме того, количество копий гена возрастает во много раз за счет того, что в хлоропластах геном представлен десятками копий, а хлоропластов в клетке несколько сотен. Считается также, что присутствие гена в хлоропластном геноме практически исключает неконтролируемое распространение введенного гена на другие растения через пыльцу, так как хлоропластный геном наследуется только по женской линий, через цитоплазму яйцеклеток.

–  –  –

В настоящее время созданные на основе введения генов энтомотоксинов сорта кукурузы, сои, рапса, хлопчатника по занимаемым площадям находятся на втором месте после гербицидоустойчивых трансгенных растений. С учетом того, что значительная часть современных генетически модифицированных сортов этих культур являются одновременно и гербицидоустойчивыми и энтомоустойчивыми, можно говорить о несомненном успехе этого направления. Причем количество модифицируемых по такой методике видов растений постоянно растет, и в их число включаются и виды культивируемых древесных растений, в частности тополь, орех, ель и другие.

Уже на начальных этапах осуществления проектов по созданию энтомоустойчивых растений на базе токсинов Bacillus thuringiensis обсуждались возможные недостатки их применения в широких масштабах. Один из них – это возможность появления к устойчивых к данному токсину вредителей из-за создаваемого давления отбора.

Возможный путь преодоления этого недостатка – это создание генетических конструкций, в которых экспрессия гена энтомотоксина осуществляется с регулируемых промоторов, что позволит вызывать образование токсина только на определенном этапе вегетации. На модельных растениях табака были опробованы конструкции с промоторами генов PRбелков (pathogenesis-related proteins, они появляются в растении только при контакте с патогенами), экспрессию которых можно вызвать опрыскиванием нетоксичными химикатами, например, салициловой кислотой. На табаке было показано, что одноразовое применения такого препарата приводит к накоплению в клетках трансгенного растения достаточного для защиты от вредителя количества токсина, а затем он постепенно разрушается, тем самым не создаются условия селективного давления.

Помимо уже получившего практическое воплощение использования генов энтомотоксинов, разрабатывают еще один подход в создании энтомоустойчивости.

Известно, что некоторые растения защищены от вредителей конкретных видов благодаря способности синтезировать ингибиторы пищеварительных ферментов. На табаке было показано, что ген ингибитора протеиназы из вигны китайской под промотором 35S РНК CaMV (Р35S) и с сайтом терминации транскрипции-полиаденилирования из гена нопалинсинтазы (tNOS) обеспечивает образование около 2 мкг ингибитора трипсина на 1 мг общего белка и это существенно снижает повреждаемость трансгенных растений личинками совки (Heliothis virescens). Ген ингибитора протеиназы II картофеля модифицировали путем введения в последовательность первого интрона гена актина риса между промотором и структурной частью и затем методом бомбардировки ввели в клетки риса. Полученный трансгенный рис повреждался личинками розового стеблевого точильщика Sesamia inferens только на 20%, тогда как исходный сорт имел поражения на уровне от 70 до 100%. Считается, что ингибиторы протеаз из традиционно употребляемых в пищу растений даже при сверхэкспрессии не могут влиять на сельскохозяйственных животных и человека и в тоже время должны защищать от нескольких видов вредителей одновременно, поэтому такой подход продолжают разрабатывать.

Помимо ингибиторов протеаз использовали и ингибитор -амилазы из растений фасоли. Ген был поставлен под промотор гена фитогемагглютинина бобов и введен в геном Pisum sativum, что сделало эти растения защищенными от Callosobruchus maculatus (зерновка бобовых) и Callosobruchus chinensis (долгоносик лучистой фасоли).

В отношении непищевых и некормовых растений пробуют еще один подход.

Известно, что холестеролоксидаза токсична для личинок жесткокрылых предположительно за счет того, что разрушает мембраны клеток среднего отдела кишечника (фермент окисляет 3-гидроксистероиды до кетостероидов с образование перекиси водорода). Ген холестеролоксидазы стрептомицетов под промотором вируса мозаики норичника шишковатого и терминатора tNOS испытали на табаке и ввели затем в хлопчатник с целью создания защиты от Anthonomus grandis grandis (хлопковый долгоносик).

Предполагается в дальнейшем комбинировать гены бациллярных энтомотоксинов, гены ингибиторов пищеварительных ферментов и ген холестеролоксидазы либо в одной конструкции, либо путем последовательного введения в геном конкретных растений. При этом перспективы видят и в использовании пластидного генома как места интеграции и экспрессии вводимой генетической информации, поскольку за счет повышения дозы гена можно достигать более высоких уровней энтомоустойчивости.

В 2015 году немецкими исследователями из Макс-Планк-Института в журнале «Сайнс» была опубликована статья (Zhang J, Khan SA, Hasse C, Ruf S, Heckel DG, Bock R.

Science. 2015 Feb 27;347(6225):991-4), в которой сообщалось о реализации еще одного направления в создании энтомоустойчивых растений, основанного на явлении РНКинтерференции. В этой работе путем введения в пластидную ДНК картофеля двух копий гена -актина колорадского жука в противоположных ориентациях добились накопления в хлоропластах соответствующей этому гену двунитевой РНК. Локализация двунитевой РНК в хлоропластах защищает ее от разрушения системой РНК-интерференции картофеля, но при скармливании трансгенного картофеля личинкам колорадского жука такая РНК проникает в клетки личинки и вызывает там РНК-интерференцию. Это приводит к отсутствию синтеза -актина и гибели личинок.

Использованный в этой работе механизм РНК-интерференции заключается в следующем (рис. 12). Клетки эукариотических организмов используют определенный белок, который называется Dicer, как для разрушения двунитевой РНК вирусов, так и для определенной формы посттранскрипционной регуляции активности генов.

Рис. 12. Механизм РНК-интерференции, работающий на двунитевых РНК.

Пояснения см. в тексте.

Собственно белок Dicer является эндорибонуклеазой класса III, которая получила свое название из-за того, что разрезает длинные двунитевые молекулы РНК на короткие фрагменты (один из переводов глагола dice – нарезать кубиками). Образующиеся при этом фрагменты двунитевой РНК протяженностью 21-23 пары нуклеотидов (они обозначаются как siRNA, в отличие от работающих в других механизмах РНК-интерференции микроРНК, обозначаемых miRNA) разделяются на однонитевые фрагменты, при этом антисмысловая нить связывается с особым ферментным комплексом RISC (RNA-induced silencing complex). Далее происходит комплементарное взаимодействие этого фрагмента с матричной РНК и разрезание ее входящими в RISC нуклеазами, что и делает ее непригодной для трансляции. Как результат в клетке не появляется белок, соответствующий тому гену, с которого снята информация, что трактуется, как «молчание» (в англ. silencing) гена.

Такое, условно говоря, «выключение» гена при полном его сохранении в геноме, получило еще одно название - «нокдаун гена», поскольку практикуемое в современной генетической инженерии направленное изменение нуклеотидной последовательности гена или полное удаление его из генома традиционно называют «нокаут гена».

Трансгенные растения, устойчивые к болезням Существенный ущерб растениеводству наносят также болезни растений, возбудителями которых являются вирусы, бактерии и грибы.

Одним из подходов в создании вирусоустойчивости является введение в растительный геном вирусных генов, кодирующих белки капсида. Основание для этого служат установленная достаточно давно закономерность: при накоплении в растительных клетках белка вирусных оболочек репродукция вируса (синтез его нуклеиновой кислоты) если не прекращается, то существенным образом снижается. Экспрессия поставленного под сильный промотор гена вируса может давать такое количество белка, которое соответствует количеству, ограничивающему репродукцию.

Этот подход оказался оправданным для защиты растений от целого ряда вирусов:

были получены устойчивые варианты картофеля (вирус скручивания листьев, S-вирус, Х-вирус, Y-вирус), тыквы (вирус мозаики арбуза 2, вирус желтой мозаики кабачков), томатов (вирус табачной мозаики, вирус мозаики томатов), огурца (вирус мозаики огурца

– CuMV), папайи (вирус кольцевой пятнистости папайи), риса (вирус полосатости риса), люцерны (вирус мозаики люцерны), табака (к вирусам собственно табачным: вирус гравировки табака, вирус полосатости табака, вирус табачной мозаики, вирус погремковости табака), к вирусам других растений: вирус скрытой мозаики сливы, вирус мозаики резухи, вирус мозаики сои, вирус бронзовости томата).

Еще один поход – введение в геном растения тех же генов белков оболочки вируса, но дающих антисмысловую РНК (минус-РНК), что достигается синтезом in vitro двунитевой кДНК таким образом, чтобы при транскприпции синтезировалась коплементарная значащей нити последовательность. Идея здесь такова: при наличии в клетке значительных количеств антисмысловой РНК она должна взаимодействовать комплементарно с мРНК заражающего растение вируса и препятствовать тем самым ее трансляции, как теперь известно, за счет разрушения двунитевых РНК по механизму РНКинтерференции. Подход был опробован на табаке с РНК4 вируса мозаики огурца, но оказалось, что трансгенные растения устойчивы только при низкой инфицирующей дозе вируса. Вероятно, количества антисмысловой РНК не хватает для связывания множества молекул, образующихся при массированном заражении. В силу этого такой прием пока не находит широкого применения.

Оба этих подхода имеют недостаток – трансгенное растение будет защищено только от одного конкретного вируса. Для защиты от следующего вируса по такой же схеме необходимо вводить в геном сорта новые гены. Поэтому продолжают разрабатывать подходы, основанные на использовании последовательностей, кодирующих так называемые сателлитные РНК. Эти нетранслируемые РНК появляются в клетках растений в период репродукции в них вирусов, причем при увеличении количества такой РНК ослабляется проявление симптомов вирусной инфекции и ограничивается распространение вируса по растению. Интеграция в геном растения кДНК, полученных на таких сателлитных РНК, повышает устойчивость к вирусу, что было продемонстрировано на модельных растениях табака.

Опробовано и создание повышенной вирусоустойчивости за счет введение в геном табака генов, кодирующих обладающие низкой специфичностью рибонуклеазы. Для этого российскими учеными из Сибирского и Дальневосточного отделений РАН были выбраны ген бактерии Serratia marcescens и ген панкреатической рибонуклеазы быка.

Генетические конструкции, в которые эти гены были поставлены под дающий средний уровень экспрессии промотор гена маннопинсинтазы, вводили путем агроинфекции в ядерный геном табака. Гомогенаты тканей трансгенных растений с геном панкреатической РНКазы быка показали уровень нуклеазной активности в 7-10 раз выше, чем гомогенаты тканей исходного сорта. Проверка устойчивости трансгенных растений к вирусу табачной мозаики (ВТМ) подтвердила возможность такого подхода: при низкой инфицирующей дозе ВТМ симптомов поражения вообще не наблюдалось, а уровень проявления симптомов при высоких инфицирующих дозах был значительно снижен.

Помимо использования собственно вирусных генов возможно использование также генов антивирусных белков некоторых растений. В последнем случае опираются на работу Lodge, Kanewski, Tumer (1993, Proceed. Natl. Acad. Sci. USA), в которой использовались белки Phytolacca americana – PAP, PAPII и РАР-S, создающие защиту от вирусов при использовании водных суспензий этих белков для опрыскивания. Гены этих белков вводили в табак и картофель и поражаемость растений X- и Y-вирусами картофеля существенно снижалась. Но достичь полной защиты не удалось, поскольку при постановке этих генов под сильные промоторы растения плохо росли и утрачивали способность к семенному размножению.

Устойчивость к фитопатогенным грибам пытаются создавать на основе повышения уровня экспрессии некоторых белков растений. Установлено, что при контакте с патогенами растения способны либо повышать уровень синтеза определенных белков, либо экспрессировать белки, отсутствующие в тканях растения до контакта с патогеном. Такие белки принято называть PR-белками (pathogenesis-releated proteins).

Некоторые из этих белков еще не охарактеризованы по структуре и функциям, но часть уже изучена. В частности, это так называемые хитиназы (разрушают -1,4-связи между молекулами N-ацетил–D-глюкозамина в хитине) и -1,3-глюканазы, которые также эффективно действуют на клеточную стенку грибов.

Гены хитиназ и глюканаз из разных растений клонированы, их можно объединять с последовательностями сильных конститутивных (например, p35S РНК CaMV) или избирательно индуцируемых промоторов (например, светоиндуцируемых промоторов из генов системы фотосинтеза) для экспрессии только в зеленых частях растения. Последнее важно потому, что у некоторых растений, в частности у риса, на корнях обитает полезный для растений гриб Glomus mosseae, снижение численности которого было бы неблагоприятно для растения. Получены уже растения табака, рапса и риса, в клетках которых экспрессированы одновременно ген хитиназы и ген -1,3-глюканазы и продемонстрирована более высокая устойчивость этих растений по сравнению с изначальными сортами.

Ведется работа по использованию других противогрибных PR-белков, в частности, тауматинподобных белков (см. раздел «Трансгенные растения с улучшенными вкусовыми и товарными качествами» данного курса) и ингибиторов протеаз, которые также могут неблагоприятно действовать на мицелий грибов. Кроме того продолжается клонирование генов новых PR-белков, например, из картофеля, и изучение их функций. Предполагается, что можно защищать определенные виды растений путем повышения уровня экспрессии их же собственных генов, при условии, что такая сверхэкспрессия не будет влиять на рост и урожайность растения.

По поводу создания устойчивости сельскохозяйственных растений к бактериальным поражениям пока идут только подготовительные исследования. Большая часть вызываемых бактериями повреждений связаны либо с мацерацией растительных тканей за счет пекто- и целлюлолитических комплексов (различного рода гнили вегетирующих или покоящихся – клубни, корнеплоды, луковицы – растений), либо с закупоркой транспортных систем растения выделяемыми патогенными бактериями экзополисахаридами (так называемое системное увядание растений). Как правило, растения защищаются от бактериальных атак посредством развития реакции гиперчувствительности, суть которой заключается в быстром отмирании пораженного участка того или иного органа, что ограничивает дальнейшее существование и распространение патогена на еще здоровые ткани. Каких-либо активнодействующих против бактерий защитных белков у бактерий не выявлено, хотя PR-белки в пораженном растении появляются. Есть мнение, что ингибиторы протеаз могут каким-то образом противодействовать бактериальной атаке, поскольку часть ферментов пектолитического комплекса некоторых бактерий (например, Pectobacterium) приобретают активность только после воздействия секретируемых специально для этого протеаз. Однако действие самих протеаз и их подверженность ингибированию растительными ингибиторами пока еще не изучены.

Делались попытки придать растениям способность продуцировать антибактериальные вещества, действующие непосредственно на клетки бактерий, а не на их факторы патогенности. В частности, в растения картофеля ввели ген лизоцима бактериофага Т4 под промотором 35S РНК CaMV. Для того чтобы белок секретировался в апопласт (межклеточное пространство растительных тканей), где и локализуются бактерии, к последовательности гена лизоцима была присоединена последовательность сигнального пептида из гена -амилазы ячменя. И хотя количества лизоцима в апопластной жидкости было не очень высоким, у таких растений картофеля наблюдалась снижение повреждаемости тканей возбудителями мягкой гнили из рода Pectobacterium.

Еще одним обнадеживающим фактом является получение модельных растений табака, имеющих устойчивость одновременно к грибным и бактериальным болезням. В пластидный геном таких растений ввели искусственно синтезированную последовательность, кодирующую пептид MSI-99, состоящий из 22 аминокислотных остатков и являющийся аналогом атимикробного пептида магаинина-2 из клеток Xenopus laevis (африканской шпорцевой лягушки), который секретируется в слизь этих животных.

За счет встраивания в хлоропластный геном количество пептида MSI-99 было доведено до 43% от общего белка клеток листьев. Это сообщало растениям табака высокий уровень устойчивости как к грибу Colletotrichum destructivum (возбудитель антракноза табака), так и к бактериальному патогену Pseudomonas syringae pv. tabaci.

Трансгенные растения, устойчивые к неблагоприятным факторам среды Устойчивость растений к абиотическим стрессам также находится в поле зрения специалистов по генетической инженерии растений, поскольку возделывание растений в ряде регионов мира ограничено из-за неблагоприятной периодичности выпадения осадков и высокой концентрации солей в почвах. У растений, приспособленных к обитанию в почвах, из которых в растение поступает малое количество воды, выявлена способность синтезировать и накапливать в клетках низкомолекулярные вещества, так называемые осмопротекторы. В такой роли могут выступать сахара, спирты, четвертичные производные аммиака, некоторые аминокислоты (пролин) и такое вещество, как бетаин.

Последний образуется в клетках растений из холина в два этапа, первый катализируется холинмонооксигеназой, второй – бетаинальдегид-дегидрогеназой. Но образовывать бетаин могут не все растения и среди них достаточно мало сельскохозяйственных. На табаке было показано, что можно либо перенести из продуцирующих бетаин растений (например, шпината) два гена, или использовать ген микроорганизмов, у которых один фермент – холиндегидрогеназа катализирует оба превращения. В последнем случае ген betA из E. coli переносили под промотором 35S РНК CaMV, и солеустойчивость повысилась на 80%.

Для повышения выраженности признака успешно использовали прием повышения дозы вводимого гена. При введении гена холинмонооксигеназы из генома свеклы обыкновенной в пластидный геном табака получили растения, устойчивые к концентрации NaCl 150 мМ/л. Введение в хлоропласты моркови гена бетаинальдегиддегидрогеназы из клеток E. coli повысило устойчивость растений к солевому стрессу до уровня 400 мМ NaCl на литр, что значительно превышало устойчивость, полученную при введении этого же гена в хромосомную ДНК растений путем агробактериальной трансформации.

Продемонстрирован и еще один путь создания в клетках растений повышенной концентрации осмопротекторов. В начале 2000-х годов российскими учеными из СО РАН опробован вариант повышения концентрации пролина за счет снижения активности пролиндегидрогеназы путем РНК-интерференции («сайленсинга» гена). Для этого в ядерный геном растений табака вводили генетические конструкции, обеспечивающие формирование двунитевых РНК на основе мРНК пролиндегидрогеназы (рис. 13).

Конструкция 1 содержала селективный ген для отбора растительных клеток NPTII и последовательность гена пролиндегидрогеназы в обратной ориентации под конститутивно действующим сильным промотором. Конструкция 2 содержала один и тот же фрагмент гена пролиндегидрогеназы, но транскрибируемый с одного промотора в двух противоположных ориентациях. При экспрессии обеих конструкций в растительных клетках должны получаться двунитевые РНК, запускающие тот вариант РНКинтерференции, который приведет расщеплению мРНК пролиндегидрогеназы. И действительно, на модельных растениях табака продемонстрировано снижение продукции разрушающего пролин фермента и, как следствие этого, повышение неспецифической стрессоустойчивости, то есть устойчивости сразу к нескольким неблагоприятным факторам среды (повышенная концентрация солей, присутствие солей тяжелых металлов, засухе).

Рис. 13. Конструкции для «сайленсинга» гена пролиндегидрогеназы (ПДГ). RB – правый концевой повтор Т-ДНК, LB – левый концевой повтор Т-ДНК, NPTII – ген бактериальной неомицинфосфотрансферазы II, p35S – промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.

Важно, что при реализации этого подхода с использованием конструкции 2 в геном растения не вводились гены, кодирующие чужеродный белок, а значит, условно, такие растения можно юридически и не относить к ГМО. Плюс к этому, в данной конструкции нет гена антибиотикорезистентности – отбор трансформированных клеток растений сразу же проводили на среде с повышенным содержанием солей, которое и срабатывало, ка селективный агент. Это позволяет снять один из доводов противников создания и распространения ГМО, суть которого в том, что трансгенные растения теоретически могут служить источником генов устойчивости к антибиотикам для болезнетворных микроорганизмов.

Повысить устойчивость к нехватке воды можно за счет накопления в клетках еще одного осмопротектора – трегалозы. Введение в пластидный геном табака гена tps1 из генома дрожжей Saccharomyces cerevisiae, кодирующего трегалозо-6-фосфатсинтетазу, в 25 раз повысило уровень трегалозы в растениях и соответственно устойчивость растений к нехватке воды. Очень существенно то, что при экспрессии этого же гена, введенного в хромосомы табака путем агробактериальной трансформации, у растений наблюдается резкое ухудшение роста побегов, изменение формы листьев и частичная утрата способности к семенному размножению. Этот нежелательный плейотропный эффект, связанный с присутствием повышенных количеств трегалозы в цитоплазме клеток, был снят синтезом и накоплением трегалозы в пластидах.

Устойчивость к заморозкам также удалось повысить путем введения генов в пластидный геном. Здесь были использованы ген 9-сатуразы (дельта-9-сатуразы) из дикорастущего вида картофеля Solanum commersonii и такой же ген из цианобактерии Anacystis nidulans. Этот фермент является одним из ключевых ферментов в путях биосинтеза жирных кислот и при его высоком количестве повышается уровень продукции липидов с ненасыщенными жирными кислотами.

Опробована возможность получения трансгенных растений, устойчивых к тяжелым металлам, которые предполагается использовать для фиторемедиации (очистки с помощью растений) загрязненных почв. В этом случае в пластидный геном табака вводили оперон из двух генов из бактериального транспозона, определяющего устойчивость бактерий к ртути. Первый из них кодирует редуктазу неорганических ионов ртути, второй - лиазу, разрушающую органические соли ртути. Такие растения росли в присутствии и органических и неорганических солей ртути.

Физиологами растений было показано, что при стрессовых воздействиях физических факторов (повышенная температура, избыточная освещенность, большая, чем обычно, доза ультрафиолета) в клетках растений образуется надпероксидный анион О2, что и вызывает нарушение обычного метаболизма и, как следствие этого, ограничение в росте, развитии и формировании клеток и органов. Как и у всех аэробных организмов, у растений имеется защита от этого аниона – фермент супероксид-дисмутаза, причем существует несколько ее изоформ, различающихся по ионам металлов, входящих в состав кофермента. Это Cu/Zn-супероксид-дисмутаза, Mn-супероксид-дисмутаза и Feсупероксид-дисмутаза (последняя имеется не у всех видов покрытосеменных).

Каждая из них локализуется в норме в характерных для этой изоформы компартментах клетки:

Cu/Zn – в хлоропластах и в меньших количествах в цитоплазме клеток, Mn-содержащая – в митохондриях. Гены этих двух ферментов были клонированы посредством выделения соответствующих матричных РНК и синтеза in vitro кДНК и затем оба варианта под промоторами 35S РНК CaMV были введены в клетки табака. Оказалось, что растения со сверхэкспрессией гена Cu/Zn-супероксид-дисмутазы могли фотосинтезировать при повышенном уровне освещенности, тогда как у обычных растений в таких же условиях интенсивность фотосинтеза резко снижалась. Проверка обоих вариантов на чувствительность к обработке озоном показала, что лучший эффект защиты достигается при сверхэкспрессии гена Mn-содержащей супероксид-дисмутазы. Оба варианта оказались устойчивы также к гербициду метилвиологену.

Помимо защиты от стрессового воздействия вегетирующих растений предполагается использовать гены супероксид-дисмутаз для сохранения свежести срезанных растений, в частности, транспортируемых на длительные расстояния цветов, поскольку физиологами растений установлено, что характер изменений в лепестках срезанных растений определяется также повышением количества свободных радикалов кислорода.

Трансгенные растения с улучшенными вкусовыми и товарными качествами Сохранность некоторых продуктов растениеводства в ходе их транспортировки и хранения всегда было важнейшей задачей, и для ее решения приходилось использовать либо раннюю уборку (съем незрелых плодов), либо обработку плодов химическими препаратами, предотвращающими выработку клетками этилена (размягчение плодов происходит в результате активации выделяемым этиленом генов растительных целлюлаз и полигалактуроназ, которые в незрелых плодах неактивны). Для решения этой проблемы были использованы несколько подходов.

Один из них заключается в получении кДНК на матрицах зрелых информационных РНК этих генов и создания конструкций, дающих при экспрессии в клетках растений антисмысловую РНК. В плодах томатов с антисмысловой РНК полигалактуроназного гена количество фермента составляет только 10% от такового в плодах обычных сортов, и именно эти сорта, известные как FLAVR SAVR, получили самое широкое распространение.

Следующий подход состоит в получении растений, не продуцирующих этилен. Для этого пришлось изучить путь биосинтеза этилена и выяснить, что предшественником его является S-аденозилметионин, под воздействием фермента АСС-синтетазы он превращается в 1-аминоциклопропан-1-карбоновую кислоту (АСС), которая затем расщепляется АСС-оксидазой на углекислый газ, аммиак, муравьиную кислоту и этилен.

Затем были получены генетические конструкции, дающие при экспрессии антисмысловые РНК АСС-синтетазы и АСС-оксидазы, и их введение в растение приводило к гораздо более медленному накоплению этилена в тканях плода. Кроме того, известно, что у бактерий имеется фермент АСС-дезаминаза, которая превращает АСС в -кетобутират, отщепляя от нее аммиак. Бактериальный ген под промотором 35S РНК CaMV ввели в клетки томата и также получили растения с медленно созревающими плодами. Именно этот подход пробуют применить к другим плодовым растениям, поскольку в этом случае нет необходимости получать кДНК конкретных полигалактуроназ и целлюлаз из данного вида растений. Полученный на такой основе сорт мускусной дыни уже используется, а другие трансгенные растения с такими свойствами (бананы) проходят полевые испытания.

Помимо лежкости, для производителей плодоовощной продукции существенным фактором является вкус и вид продаваемых товаров. Один из вариантов придания плодам более сладкого вкуса – использования гена белка монеллина из плодов тропического растения диоскореофиллум Каминса (Dioscoreophyllum cumminsii, пор. Ranunculales, сем.

Menispermaceaea – Луносемянниковые, плод – костянка). Этот белок в 3000 раз слаще сахара и в 100 000 раз слаще сахарозы и утилизируется, естественно, не через углеводный обмен, что делает его потенциально приемлемым в производстве продуктов для диабетиков. Однако этот белок очень не стоек термически и его четвертичная структура легко распадается в слабых растворах органических кислот (две его цепи – из 45 аминокислотных остатков и из 50 – разъединяются), в результате чего утрачивается сладкий вкус. Для введения этого белка в традиционно потребляемые в сыром виде растения использовали последовательность, кодирующую обе цепи монеллина, причем для получения трансгенных томатов ее «поставили» под промотор белка Е8, активный на этапе созревания плодов, а для салата – под промотор 35S РНК CaMV, терминаторы транскрипции и сайты полиаденилирования были из гена нопалинсинтазы. C использованием агробактериальной коинтегративной векторной системы конструкции ввели в изолированные клетки этих видов, и получили после регенерации целостные растения, в листьях (у салата) и зрелых плодах (томаты) которых присутствовал монеллин.

Делаются попытки использовать гены и еще некоторых сладких белков – тауматинов. Первоначально такие белки были описаны при изучении сока растения из дикорастущей флоры Западной Африки из семейства Thaumatococcus daniellii Марантовые, что и дало им название. Плоды этого ныне культивируемого в тропических районах разных континентов растения дают смесь соединений пептидной природы, которые используются как подсластители в пищевой промышленности.

Как уже отмечалось выше, тауматиноподобные белки в небольших количествах синтезируются в клетках многих видах растений и относятся к PR-белкам, синтез которых резко увеличивается при контакте растения с патогенами, особенно с фитопатогенными грибами. Поэтому в генно-инженерном плане кДНК таких белков интересует как селекционеров, работающих по созданию устойчивых к грибным заболеваниям сортов, так и селекционеров, создающие сорта растений с улучшенным вкусом.

Чаще всего используется отклонированный еще в начале 1980-х годов в Лейденском университете (Нидерланды) ген тауматина II, который распространился по многим лабораториям мира. В частности, в Россию он попал из лаборатории англо-голландской фирмы Unelever в первой половине 1990-х годов и используется до сих пор в целом ряде институтов РАН и РАНСХ. Классический вариант бинарного вектора, используемого для введения гена тауматина II, представлен на рис. 14.

В системе российских академий наук с использованием этого вектора осуществлена трансформация растений томата, земляники, яблони, груши, моркови, картофеля и ряда других растений. Большинство испытанных трансгенных линий проявляли повышенную устойчивость к грибным заболеваниям, а плоды, клубни и корнеплоды были в меньшей степени подвержены гнилям. В частности, полученные на станции искусственного климата «Биотрон» филиала Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН линии садовой земляники (Fragaria ananassa) имеют повышенную на 25-30 % устойчивость к серой гнили (возбудитель - Botrytis cinerea) по сравнению с исходными сортами и одновременно обладают улучшенными вкусовыми качествами.

Рис. 14. Плазмида из бинарной векторной системы для введения в клетки растений гена тауматина II. pNOS – промотор гена нопалинсинтазы, pAnos – полиА-участок (терминирующий участок) из гена нопалинсинтазы, nptII – ген бактериальной неомицинфосфотрансферазы, p35S – промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, RB – правый концевой повтор Т-ДНК, LB – левый концевой повтор Т-ДНК.

Еще одна проблема пищевого растениеводства – изменение цвета растительных тканей при хранении и механическом воздействии, что резко снижает их товарный вид.

Происходит оно из-за катализируемого полифенолоксидазами превращения монофенолов и орто-дифенолов в орто-хиноны. Гены полифенолоксидаз имеют ядерную локализацию, но их продукты локализуются в митохондриальных и пластидных мембранах. Получение кДНК картофельной полифенолоксидазы стало основанием для создания нескольких конструкций. Было получено шесть вариантов, поскольку сразу испытывались три промотора и кДНК в смысловой и в антисмысловой ориентациях: под промотором 35S РНК CaMV, под промотором гена синтазы гранулосвязанного крахмала (pGBSS) и под промотором гена пататина (pPATATIN). Два последних промотора активны только в тканях клубней, где и идет накопление крахмала и пататина (запасного белка) в лейкопластах. Сайт терминации/полиаденилирования был во всех случаях tNOS.

Успешными оказались конструкции с двумя первыми промоторами и кДНК в антисмысловой ориентации – клубни таких трансгенных растений гораздо меньше чернели при разрезании.

Внешний вид товара особенно важен для производителей декоративных и цветочных растений. У многих покрытосеменных растений окраска венчика обусловлена синтезом специфических пигментов – антоцианинов, относящихся классу флавоноидов и синтезируемых из фенилаланина. Общим предшественником для таких пигментов является 4,2,4,6-тетрагидроксихалкон, синтезируемый под контролем халконсинтазы и являющимся веществом желтого цвета. Если тетрагидроксихалкон под влиянием халконизомеразы превращается в нарингенин, а затем под воздействием флаванон-3гидроксилазы в дигидрокемпферол, окраска исчезает, поскольку оба эти вещества бесцветны. Но зато дигидрокемпферол может превращаться в клетках различных растений либо в вещества синего цвета, являющиеся производными дельфинидина, либо в вещества красного цвета – производные цианидина. У петунии превращение в цианидинпроисходит под воздействием флаваноид-3-гидроксилазы, дающей 3-глюкозид бесцветный дигидрокверцитин, который уже под воздействием дигидрофлаванол-4редуктазы превращается в конечный красный продукт. Образование синего дельфинидингликозида идет путем катализируемого флаваноид-3,5-гидроксилазой превращения в бесцветный дигидромирицетин, на который уже действует все та же дигидрофлаванол-4редуктаза. Сравнение дигидрофлаванол-4-редуктаз разных растений показало, что они несколько различаются по свойствам: могут действовать на разные субстраты и давать при этом различные продукты. В частности, дигидрофлаванол-4-редуктаза кукурузы может действовать на дигидрокемпферол и превращать его в пеларгонидин-3-гликозид, который имеет оранжево-красный (кирпичный) цвет. То есть при введении в клетки петуний гена дигидрофлавонолредуктазы из генома кукурузы получаются растения с нехарактерным для петуний цветом лепестков, в силу чего такие трансгенные сорта пользуются определенной популярностью.

Помимо манипуляций с генами дигидрофлаванол-4-редуктаз, генно-инженерным путем были получены чисто белые, нежно-розовые или нежно-голубые варианты хризантем, гвоздик и тюльпанов. Для этого в геном растений вводили кДНК матричных РНК халконсинтазы под конститутивно действующим промотором 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, причем как в смысловых, так и в антисмысловых ориентациях.

В обоих случаях подавлялась продукция фермента, но с различной эффективностью. При сверхэкспрессии гена (вставка кДНК в смысловой ориентации) наблюдалось снижение продукции халконсинтазы и вследствие этого уменьшение интенсивности окрашивания лепестков. Вставка этой же кДНК в антисмысловой ориентации приводила к полному отсутствию синтеза халконсинтазы, в результате чего венчик получался абсолютно белым.

Еще одним ярким примером успехов генетической инженерии декоративных растений является история получения так называемых голубых роз. Дело в том, что с тех пор, как цветоводы одомашнили разные виды шиповника и получали путем естественной селекции множество сортов культурных роз, в течение около 5000 лет никому не удавалось получить сорта с синими оттенками лепестков. Более того, голубые розы стали своеобразным синонимом недостижимого, что отражено в литературе разных эпох и народов. Одним из известных примеров этого является стихотворение Р. Киплинга «Голубые розы». Приходилось идти на ухищрения и выращивать белоцветные сорта, например, на субстратах с добавлением солей меди или помещать уже срезанные цветы в растворы с красителями. Но для настоящих цветоводов такие подходы были неприемлемы

– с развитием наук создать настоящие голубые розы стало делом чести цветоводов.

Например, в 1840 году бельгийское и британское садоводческие общества совместно учредили приз размером 500 000 франков, который должен был получить тот, кто выведет голубую розу. И только в конце 20-го века, благодаря успехам биохимии растений, стало понятно, что голубых роз действительно не бывает и быть не может – клетки шиповника не имеют ферментов, способных превратить дигидрокемпферол в дельфинидин.

Однако у других растений есть гены, определяющие синтез антоциановых пигментов дельфинидинового семейства, что и стало основанием для генно-инженерных работ в этом направлении. В 1986 в Австралии была образована биотехнологическая фирма Calgene Pacific, которая ставила своей главной коммерческой целью именно создание голубых роз. В 1994 году эта фирма поглотила своего голландского конкурента фирму Florigene и стала использовать ее название.

В 1991 году в этой фирме был клонирован ген дельфинидина из петунии, что стало первым шагом на пути к голубой розе. К середине 1990-х годов исследователи из Florigene усовершенствовали методы генной трансформации розы и регенерации растений из трансформированных клеточных линий в культуре ткани, что позволило создать первый трансгенный вариант с высоким уровнем экспрессии гена дельфинидина, но это не привело к конечной цели, так как работы велись на красноокрашенном сорте роз «Кардинал». В лепестках этих трансгенных роз образовывалась смесь цианидина и дельфинидина, что давало очень привлекательный темно-фиолетовый цвет, но никак не голубой.

Параллельно с работами по созданию голубых роз в лабораториях Florigene проводили исследования по трансформации других декоративных цветковых растений.

При экспрессии гена дельфинидина из петунии в клетках белоцветковой гвоздики, у которой был мутирован ген дигидрофлаванолредуктазы, были получены линии гвоздик с лепестками голубых и фиолетовых оттенков, взятые во второй половине 1990-х годов как основа для так называемой «лунной» группы сортов гвоздики. К 2005 году на рынках срезанных гвоздик в большинстве стран Северной и Южной Америки доминировали сорта Moondust (Лунная пыль) Moonglow (Лунное сияние) и Moonshadow (Лунная тень), и постоянно велись переговоры по поводу получения разрешения для реализации их на рынках Европы.

С учетом этого были проверены пригодные для выращивания на срезку белоцветковые сорта роз на наличие среди них мутантов по гену дигидрофлаванолредуктазы, но таковых не обнаружили. И тогда было решено осуществить «выключение» гена дигидрофлаванолредуктазы путем введения в клетки розы последовательности этого гена в обратной ориентации. К этому времени в японском филиале фирмы Florigene, который называется Suntory Flowers, отклонировали ген дельфинидина из фиалки и ген дигидрофлаванолредуктазы из ириса. В этом филиале и была создана генетическая конструкция для создания истинно голубых роз. Она содержала ген дигилрофлаванолредуктазы розы в обратной ориентации, ген дельфинидина фиалки и ген дигидрофлаванолредуктазы из ириса.

Полученные путем введения такой конструкции розы были получены к 2005 году, а в 2008 году на международной выставке цветов в Токио был представлен коммерческий сорт, предназначенный для реализации на рынках Японии и Северной Америки, начиная с осени 2009 года.

Интересным вариантом орнаментально-декоративных сортов могут стать растения, листовые пластинки которых испускают свет в вечернее время. Схема одного из вариантов их получения приведена в разделе «Генетические конструкции для введения генетической информации в ДНК пластид» этого курса.

Трансгенные растения с улучшенной пищевой и промышленной ценностью Основным питательным веществом для животных и человека в растительных тканях являются углеводы (крахмал, моно- и дисахариды), которые почти у всех растений одинаковы и присутствуют в значительных количествах. Количество же белков и тем более их аминокислотный состав не соответствуют запросам животноводства и пищевой промышленности, поскольку в белках растительного происхождения необходимых для полноценного питания незаменимых аминокислот недостаточно.

Наиболее насыщенными белками органами растений являются семена, где накапливаются так называемые запасные белки. Изучение аминокислотного состава запасных белков семян у различных растений показало, что количество тех или иных незаменимых аминокислот является видовым признаком и контролируется совокупностью соответствующих генов. Это послужило основой для разработки стратегических подходов в получении растений с улучшенным набором запасных белков.

Один из подходов – совмещение в одном растении генов запасных белков из геномов растений различных видов. Принципиальную возможность такого подхода продемонстрировали еще в 1980-х годах, перенося ген фазеолина (запасного белка растений из сем. Бобовые) в клетки табака, ген зеина (запасного белка кукурузы) в клетки подсолнечника. Второй подход – это использование собственных генов тех или иных видов растений путем постановки их под более сильный промотор. Третий подход направленное изменение аминокислотного состава конкретных запасных белков (желательно тех, которые преобладают в количественном отношении) посредством введения в исходную последовательность кодонов, соответствующих незаменимым аминокислотам. Для этого в последовательность клонированного гена путем мутагенеза in vitro вводят кодоны, соответствующие незаменимым аминокислотам. Предпочтительным местом в полипептидной цепи для таких изменений признан С-концевой домен. Изучение запасных белков семян основных пищевых и кормовых растений – бобовых (фазеолины, вициллины), подсолнечника (гелиантины), злаков (ячменя – гордеины, пшеницы – глиадины и проламины, кукурузы – зеины) показало, что наибольшие различия в аминокислотных последовательностях разных белков одного и того же растения и белков из разных растений обнаруживаются в районе С-конца в так называемой гипервариабельной области. Из этого следует, что эта часть белковых молекул менее существенна для пространственной упаковки в соответствующих компартментах и значит именно в эту область можно вносить генетические изменения с наименьшими последствиями в плане изменения конформации.

Однако, экспрессия генов запасных белков семян в растении достаточно сложно регулируется, т.к. синтезируются эти белки не одновременно, а последовательно и существует конкретный порядок не только синтеза, но и укладки в протеинопластах.

Поэтому и сверхэкспрессия, и значительное изменение аминокислотного состава могут существенно повлиять на процесс формирования семян. Проблема правильной упаковки запасных белков в семенах имеет место и при экспрессии чужеродных генов. Например, фазеолин бобовых и зеин кукурузы синтезируются в табаке и подсолнечнике, но их накопление в семенах не соответствует ожидаемому.

Еще один подход в улучшении аминокислотного состава запасных белков семян связан не с изменением собственно генов этих белков, а с изменением общего количества аминокислот, синтезируемых в растении. Часть незаменимых аминокислот – изолейцин, треонин, метионин и лизин – синтезируются из аспартата и ключевыми ферментами в таком биосинтезе являются аспартаткиназа (превращает аспартат в -аспартилфосфат и этот этап обязателен для всех перечисленных выше аминокислот) и синтаза дигидродипиколиновой кислоты (DHDPS), катализирующая образование 2,3дигидропиколината, из которого далее образуется лизин. Активность обоих эти ферментов регулируется лизином по принципу обратной связи и у бактерий (у которых путь синтеза аминокислот аналогичен растительному) можно получать мутанты, нечувствительные к ретроингибированию лизином. Ген дигидродипиколинатсинтазы из Corynebacterium (dapA) и ген аспартаткиназы из Escherichia (lysCM4) были клонированы, объединены с лидерной последовательностью из гена малой субъединицы РБФК гороха, затем к обеим этим последовательностям были добавлены промоторные области из гена

-фазеолина бобов и терминаторы транскрипции из этого же гена (Pv5- и Pv3-фрагменты соответственно). Обе эти конструкции путем агробактериальной трансформации ввели в растения сои и рапса. У трансгенных растений количество лизина в клетках было в 100 раз больше, чем у исходных растений, и, что особенно поразительно, в запасных белках сои количество лизиновых остатков увеличилось в 5 раз, а в семенах рапса – в 2 раза. Основное применение такой сои видят в изготовлении из нее соевой муки, которую традиционно используют как пищевую добавку к кормам из кукурузы. Обычно к таким комбикормам обязательно добавляют лизин микробиологического производства, что и делает эти корма достаточно дорогими, следовательно, такая соевая мука удешевит комбикорм. Перспектива – введение такой же конструкции непосредственно в растения кукурузы.

Еще одним показательным примером улучшения пищевой ценности сельскохозяйственных растений является создание так называемого «золотого риса». В 1999 году клетки риса были трансформированы генетической конструкцией, которая содержала: 1) промотор гена глутелина риса, первый интрон гена каталазы клещевины, лидерную последовательность из гена малой субъединицы рибулозобифосфаткарбоксилазы гороха и ген crtI (кодирующий каротиндесатуразу - один из ферментов пути биосинтеза -каротина) из бактерий Erwinia. uredovora и терминатор из гена нопалинсинтазы; 2) промотор гена глутелина риса, первый интрон гена каталазы клещевины, ген фитоинсинтазы из нарцисса и терминатор из гена нопалинсинтазы. Такие растения синтезировали и накапливали в эндосперме рисовых семян 1,6 мкг каротиноидов на грамм веса. Зерновки такого риса имели желтый цвет, что и дало ему первоначальное название. Но при этом подчеркивалось, что этот рис и в переносном смысле является золотым, поскольку содержит провитамин А, которого обычно не хватает в пище бедных слоев населения в целом ряде азиатских стран. В этих странах широко распространены связанные с дефицитом витамина А заболевания глаз, которые приводят к необратимой слепоте, поэтому Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) приветствовала проекты по созданию и внедрению в сельское хозяйство таких трансгенных сортов.

В 2005 году этот вариант трансгенного риса был улучшен путем замены гена фитоинсинтазы из нарцисса на ген этого же фермента из кукурузы, причем в ходе этой работы ген из кукурузы был выбран как самый лучший из подобных генов перца, моркови, арабидопсиса, рапса и томатов. «Золотой рис 2» накапливает в зерновках в 23 раза больше каротиноидов, чем «золотой рис 1» – 37 мкг на грамм веса, причем более 90% этих каротиноидов составляет именно -каротин (провитамин А), что наглядно демонстрирует рис. 15.

Получены первые растения картофеля, у которых улучшены качественные характеристики крахмала. Обычно этот полисахарид в клубнях представляет собой смесь амилопектина (имеет разветвленные цепи) и амилозы (имеет линейные цепи). Крахмал считается тем более качественным, чем больше в нем амилопектина. Путем введения гена амилозы картофеля в обратной ориентации под сильным промотором получен вариант, у которого количество амилозы снизилось до нуля. Считается, что антисмысловые РНК, комплементарно взаимодействуя с РНК, считываемой с нормального гена амилазы, препятствуют ее трансляции.

Рис. 15. Слева на право: зерновки обыкновенного риса, «золотого риса 1», «золотого риса 2»

Еще одним объектом внимания специалистов по генетической инженерии стали растительные жиры. Они широко используются в пищевой и парфюмерной промышленности, а также в технических целях. Характер и объемы их использования зависят от количественного и качественного состава входящих в масло жирных кислот.

Основными масличными растениями являются соя, пальмы Cocos nucifera, Elaeis guineensis, Orbignya barbosiana, рапс и подсолнечник. Состав жирных кислот, входящих в масла различных растений не одинаков, но большая часть масличных культур дает жиры с пальмитиновой (С16), стеариновой (С18), олеиновой (С18, но есть двойная связь у 9-10-го атомов углерода), линолевой (С18, но есть двойные связи, у 9-10-го и 12-13 атомов углерода) и линоленовой (С18, но есть двойные связи у 9-10, 12-13 и 15-16-го атомов углерода) кислот. Других жирных кислот – каприловой (С8), каприновой (С10), лауриновой (С12), миристиновой (С14), петрозелиновой (С18, но есть двойная связь у 6-7-го атомов углерода), рицинолиновой (С18, но есть двойная связь у 9-10-го атомов углерода и ОН-группа у 12-го атома углерода), эруковой (С22, но есть двойная связь у 13-14-го атомов углерода) – образуется меньше.

В зависимости от того, каких именно жирных кислот в составе масел больше, эти масла находят различное применение – пищевое, косметическое или техническое, поэтому для разных отраслей промышленности приходится выращивать различные растения.

Часть из них достаточно трудно культивируемые (например, древесные) и произрастают только в определенных климатических зонах, поэтому крупные биотехнологические фирмы еще в 90-ые годы поставили перед собой получить растения с измененным составом жирных кислот. Лидером в этой области является американская корпорация Calgene, имеющая специальный Oil Department и создавшая серию масличных сортов рапса для промышленного применения. Сорта отличаются преимущественным содержанием в масле конкретной жирной кислоты, и масло это предназначается для конкретного применения: сорт с содержанием 40% стеариновой кислоты – для производства маргарина и шоколадного масла; 40% и 60% лауриновой кислоты – для производства детергентов косметического и технического применения; 80% олеиновой – для производства пищевых продуктов, смазочных материалов и чернил; 40% миристиновой – для производства детергентов, мыла и средств для ухода за кожей; 90% эруковой – для производства косметики, фармацевтических препаратов, чернил и полимеров; с повышенным содержанием петрозелиновой кислоты – для производства пищевых добавок (разрыхлители для теста – shortening), а также детергентов и полимеров;

рицинолиновой – для производства смазочных материалов, пластификаторов, фармацевтических препаратов и косметики.

Один из трансгенных вариантов рапса вообще заявлен как сорт, дающий воск симмондсии китайской. Simmondsia chinensis (пор. Hamamelidales, сем. Simmondsiaceae) или хохоба, как называют ее американские и мексиканские индейцы, уникальное по своим свойствам кустарниковое пустынное растение. В его семенах находится воскообразная жидкость, представляющая собой смесь эфиров жирных кислот и спиртов и используемая проростком как основное питательное вещество. Ни у одного из растений подобных запасных веществ нет, и ближайшим аналогом его является животный воск кашалотов, известный, как спермацет. В связи с почти полным запретом охоты на китов, хохоба являлась практически единственным источником этого вещества, которое используется в медицине (восстановление волос), для производства особых смазочных масел для автомобилей и самолетов, трансформаторного масла и пластмасс. Сколько и каких генов перенесено в рапс не сообщается, но в отношении сорта, дающего 90 % эруковой кислоты и предназначенного для производства полимеров (конкретно нейлона 13-13), указано, что были использованы 2 гена – один из хохобы, а второй - из мыльнянки луговой. В некоторых случаях оказывалось, что введение одного гена уже дает нужный результат.

Например, для получения сорта с повышенным содержанием лауриновой кислоты был клонирован и введен в геном рапса ген тиоэстеразы из калифорнийского лавра (Umbellularia californica). Продукт этого гена прерывает синтез жирных кислот на стадии 12 атомов углерода, предотвращая характерный для рапса рост цепи до 18 атомов.

Помимо рапса получен и уже допущен к коммерческому использованию сорт сои, у которого после введения дополнительной копии гена дельта-12 десатуразы той же самой сои уменьшилось количество линолевой и линоленовой кислот и увеличилось (с 23% изначально до 80%) олеиновой кислоты. Такое масло считается более ценным, поскольку меньше разлагается при нагревании и не загустевает при хранении, что делает его более привлекательным для покупателей.

Производство трансгенных сортов для промышленных целей имеет еще одно направление. Делаются попытки получения растений продуцирующих основу для природнодеградируемого пластика - поли--гидроксибутирата. Три гена, необходимые для синтеза поли--гидроксибутирата были клонированы из бактерий Alcaligenes eutrophus, но их экспрессия в клетках арабидопсиса приводила к резкому ухудшению развития растений. Этот эффект, по мнению авторов работы, мог быть следствием накопления полимера в цитоплазме, поэтому решено было добиться синтеза полимера в пластидах, которые природно предназначены для накопления полимеров, например, крахмала. Для этого всем трем генам были добавлены лидерные последовательности из гена малой субъединицы РБФК гороха, обеспечивающие транспорт синтезируемых в цитоплазме белков в хлоропласты, а качестве промотора был использован p35S RNA CaMV. Такие растения имели нормальное развитие и далее подобный подход должен быть реализован на каком-либо сельскохозяйственном растении.

Сообщалось также и о получении трансгенных растений, у которых необходимые для синтеза полигидроксибутирата гены введены в пластидный геном. Эта работа начиналась даже не в собственно биотехнологической фирме, а в институте Карнеги, но в Agracetus Incorporated уже в 1995 году начались работы по получению хлопковых растений, которые бы давали волокна, пригодные для производства не сильно мнущегося волокна (сминаемость и относительная непрочность натуральных хлопковых волокон являются причинами производства тканей, состоящих из смеси синтетики и природных волокон, что удорожает производство). Для этих целей также используются гены синтеза полиоксибутирата и были сообщения, что волокно из трансгенных растений хлопка действительно содержит до 30% полимерной добавки. Такое волокно по предположениям рекламного отдела Agracetus Incorporated будет соответствовать технологическим нормам, имеющимся для смешанных природно-синтетических волокон.

Улучшить технологические характеристики хлопкового волокна можно также за счет введения в растения хлопка генов, кодирующих образование хитиноподобных и хитиназоподобных мономеров и их включение в структуру целлюлозного волокна. Проект с таким содержанием реализуется с начала 2010-х годов в Bayer CropScience Innovation Centre, расположенном в г. Гент (Бельгия).

В целом получение трансгенных растений для технического применения является для биотехнологических фирм приоритетным направлением по целому ряду причин.

Предполагается, что для этих растений и продуктов из них получаемых легче будет получать разрешение на их применение в законодательных органах. Во-вторых, сельское хозяйство ряда промышленно развитых стран страдает от перепроизводства пищевых растений и приходится выплачивать огромные (в США от 6 до 26 биллионов долларов в зависимости от года в начале 90-х годов) правительственные субсидии фермерам для предотвращения их банкротства. Переориентация фермерских хозяйств на производство технических растений может помочь решить эту проблему. Экономисты еще в 1995 году подсчитали, что в целом продажа продукции, изготовленной на основе непищевых трансгенных растений (здесь также учитывались фармацевтические и вакцинные препараты) должна возрастать с 15 миллионов долларов в 1995 году до 320 миллионов долларов в 2005 году. Эти прогнозы реализовались и даже с опережением, так что это направление себя оправдало и продолжает успешно развиваться.

Еще одну проблему технологического характера, важную для собственно сельскохозяйственного производства, также удалось решить с помощью генетической инженерии. В современном сельскохозяйственном производстве широко используется явление гетерозиса: посевной материал целого ряда культивируемых растений (кукурузы, огурцов, томатов, пшеницы и др.) специально получают в семеноводческих хозяйствах путем скрещивания двух разных линий или сортов. Полученные в результате таких скрещиваний семена дают гетерозисные растения (поколение F1), имеющие существенное превышение в урожайности по сравнению с исходными сортами. Однако получение таких семян в промышленных масштабах всегда было сопряжено с существенными трудностями

– как избежать самоопыления и получать 100% гибридных семян? Для решения этой проблемы в середине 20-го века стали использовать ЦМС – цитоплазматическую мужскую стерильность, возникающую у некоторых растений как результат несоответствия ядерного и цитоплазматических геномов. Для некоторых сельскохозяйственных культур такие линии удалось получить, и их применение частично решило эту проблему. Но применение таких линий в семеноводстве кукурузы показало, что периодически они “дают сбои”, то есть какое-то количество семян (иногда значительное) оказывается не гибридными или в целом семян получается меньше, чем планировалось.

Поскольку имелся спрос на линии с мужской стерильностью для различных сельскохозяйственных растений, перед генными инженерами еще в конце 1990-х годов была поставлена задача получить растения с гарантировано нежизнеспособной пыльцой.

Для решения этой задачи разрабатывались различные подходы, в которых пытались использовать ядерные и митохондриальные гены растений, имеющие отношение к развитию цитоплазматической мужской стерильности, но наиболее успешными в плане коммерческой реализации оказались генетические конструкции с генами из бактерий Bacillus amyloliquefaciens. Получение на этой основе линий рапса с системой контроля опыления считают классическим примером с точки зрения современной генетической инженерии и требований биобезопасности.

В примененной здесь конструкции в качестве селективного маркера для отбора трансгенных клеток на этапе введения последовательности в растительный геном вместо традиционно используемого гена канамицинрезистентности использовали ген устойчивости к гербициду фосфинотрицину (глифозинату аммония) из клеток продуцента этого вещества – актиномицетов рода Streptomyces. Этот ген называется bar и кодирует фермент фосфинотрицин-N-ацетилтрансферазу. В результате такого подхода фактически «убили двух зайцев»: ввели в растительный геном еще один необходимый для сельского хозяйства признак (гербицидоустойчивость) и сняли вопрос о потенциально возможном распространении генов антибиотикорезистентности, о котором постоянно вспоминают противники использования генно-модифицированных растений. Но основным целевым геном в такой конструкции является ген РНКазы из бактерий Bacillus amyloliquefaciens, объединенный с тканеспецифическим промотором гена ТА29 табака, который активен только в тканях пыльника. Фактически это и позволило получить нормальное растение, у которого во всех остальных клетках, кроме клеток стенок пыльцевых камер пыльника, бациллярная РНКаза не синтезируется и РНК не разрушается. Конструкция, содержащая оба гена, получила название barnase – от bar и RNAse. Однако в том случае, когда гибриды первого поколения должны образовывать семена, необходимо восстановить фертильность, поэтому для производства гетерозисных гибридов в семеноводстве получают линии рапса, в геноме которых имеется введенная генетическая конструкция barstar. Эта конструкция отличается от barnase только тем, что в ней вместо кодирующей РНКазу последовательности содержится последовательность гена ингибитора РНКазы из тех же Bacillus amyloliquefaciens. При опылении трансгенных растений barnase пыльцой трансгенных растений barstar конструкции совмещаются в одном геноме, и в клетках тканей пыльника гетерозисных растений активность РНКазы подавляется.

Систему barnase/barstar применили к различным уже известным и хорошо зарекомендовавшим сортам рапса, и теперь производители семян получают целый ряд коммерческих гетерозисных вариантов рапса различных сортов. Причем все эти растения оказываются идентичными обычным сортам с точки зрения биобезопасности, поскольку экспрессия обеспечивающих систему контроля опыления чужеродных генов идет только в цветке, и после завязывания плодов чужеродные белки полностью исчезают из растения.

Трансгенные растения как источник медицинских препаратов Пионерными работами в этой области являются эксперименты группы Чарльза Арнтцена из Техасского университета в Хьюстоне. Им удалось показать, что экспрессируемый в клетках табака ген поверхностного белка вируса гепатита В дает белок, способный вызвать в организме лабораторных животных иммунный ответ, приводящий к продукции антител, защищающих от гепатита.

Эта же группа исследователей продемонстрировала возможность получения путем генетической инженерии растений противобактериальных вакцин. В этой работе был использован один из генов термолабильного энтеротоксина энтеропатогенных E. coli.

Этот токсин схож с токсином холерных бактерий и состоит из одной субъединицы А, массой 27 кДа (обозначается LT-A), и 5 пяти одинаковых субъединиц В, массой 11,6 кДа (соответственно LT-B). Было известно, что иммунитет определяется выработкой антител против субъединицы В, которые блокируют связывание молекулы токсина с ганглиозидом GM1 клеток эпителия кишечника, в силу чего субъединица А не проникает внутрь клетки и не может оказать токсического действия. Это стало основанием для выбора гена, кодирующего LT-B, в качестве основы для создания вакцинного препарата.

На примере этой работы можно наглядно проследить принципы и характер генноинженерных исследований такого рода, поэтому остановимся на ней подробнее.

Конструирование векторных молекул осуществляли согласно следующей схеме (рис. 16). Фрагмент, состоящий из p35S RNA CaMV и примыкающих к нему справа последовательно 5-концевой последовательности вируса гравировки табака (TEV-leader от tobacco etch virus), полилинкера и 3-концевой последовательности гена vspB из клеток сои в качестве сайта терминации/полиаденилирования, ввели в плазмиду pUC19, в результате чего получилась плазмида pIBT210. Затем с помощью ПЦР был синтезирован фрагмент длиной 67 пар нуклеотидов, который отличался от сайта инициации трансляции гена LT-B наличием сайта узнавания для NcoI, и по этому сайту вставлен в pIBT210 – получилась pLTB5. Параллельно с этим в ген LT-B в плазмиде pJC217 (эта плазмида была получена из другой лаборатории как источник гена LT-B) по SpeI-сайту была введена искусственно синтезированная последовательность SEKDEL, которая определяет накопление белка в эндоплазматическом ретикулюме, и тем самым получена плазмида pLTK217.

Из исходной плазмиды pJC217 и плазмиды pLTK217 по сайтам EcoRI и HindIII были вырезаны кодирующие области генов LT-B и LT-B-SEKDEL, соответственно, и переклонированы в pBluescript, затем вырезаны оттуда по сайтам BamHI – DraI и вставлены каждая в pIBT210, в результате чего были получены pLTB200 и pLTK200.

После этого из каждой из этих плазмид, теперь уже с помощью SacI, вырезали структурные части обоих генов и вставляли в pLTB5, что давало соответственно pLTB210 и pLTK210, в которых гены токсина объединялись с модифицированным сайтом трансляции. И на последнем этапе эти уже готовые к экспрессии гены вводили путем рестрикции по сайтам HindIII – EcoRI в векторы для агробактериальной трансформации pBI101, объединяя тем самым эти конструкции с геном для селекции растительных клеток и правым и левым концевыми повторами Т-ДНК. Так были получены pLTB110 и pLTK110, отличающиеся друг от друга только по сигналу для компартментализации.

1) Промотор CaMV35S + TEV leader + полилинкер (NcoI, BamHI, SmaI, KpnI, SacI) + 3-конец гена vspB + pUC19 = pIBT210 Лигирование по HindIII-EcoRI сайтам плазмиды pUC19

2) Ген LT-B из плазмиды pJC217 с присоединенным к нему с помощью ПЦР сайтом для NcoI + pIBT210 = pLTB5 Лигирование по NcoI-сайту плазмиды pIBT210

3) Ген LT-B в плазмиде pJC217 + сигнал накопления в эндоплазматическом ретикулюме (кодирует аминокислотную последовательность SEKDEL) = pLTK217 Лигирование по SpeI-сайту гена LT-B

4) Кодирующая область гена LT-B из плазмиды pJC217 переклонирована в плазмиду pBluescript по EcoRHindIII- сайтам, вырезана по BamHI- DraI сайтам вставлена в плазмиду pIBT210 = pLTB200

5) Кодирующая область гена LT-B- SEKDEL из плазмиды p LTK217 переклонирована в плазмиду pBluescript по EcoR-HindIII сайтам, вырезана по BamHI- DraI сайтам вставлена в плазмиду pIBT210= pLTK200

6) SacI-фрагмент из плазмиды pLTB200 + pLTB5 = pLTB210 Лигирование по SacI-сайту pLTB5

7) SacI-фрагмент из плазмиды pLTK200 + pLTB5 = pLTK210 Лигирование по SacI-сайту pLTB5

8) Переклонирование по сайтам HindIII-EcoRI сконструированной кассеты из pLTB210 в плазмиду pBI101 = pLTB110

9) Переклонирование по сайтам HindIII-EcoRI сконструированной кассеты из pLTК210 в плазмиду pBI101 = pLTK110

Рис 16. Поэтапная схема получения растений, экспрессирующих ген LT-B.

Для передачи этих конструкций в клетки табака (Nicotiana tabacum cv. Samsun) и картофеля (Solanum tuberosum variety “Frito-Lay 1607”) были использованы стандартные методики агробактериальной трансформации на основе бинарной векторной системы. Из трансформированных клеток путем выращивания каллуса и стимуляции образования органов были регенерированы растения, затем они были пересажены в почву и выращены в климокамерах при искусственном освещении. Количество LT-B-белка в листьях табака и микроклубнях картофеля определяли с помощью ELISA, базируясь на способности LTB связываться с ганглиозидом GM1.

Конкретные трансформанты проявляли различную экспрессию гена белка LT-B, но если в трансформантах, несущих только ген LT-B, максимальное количество искомого белка было 5 мкг на грамм общего растворимого белка в листьях (табак) и 30 мкг на грамм общего растворимого белка в клубнях (картофель), то в растениях с геном LT-BSEKDEL эти цифры были соответственно 14 мкг и 110 мкг. Введение очищенного белка в кровь лабораторных животных приводило к развитию иммунитета к данному эшерихиозу и, более того, кормление мышей сырыми клубнями такого трансгенного картофеля привело к развитию у животных иммунного ответа, выражавшегося в продукции специфических по отношению к белку LT-B иммуноглобулинов, в том числе и секреторного IgA. Таким образом была показана возможность создания так называемых оральных вакцин на основе трансгенных растений.

Высокая детская заболеваемость и смертность в развивающихся странах в основном обусловлена широким распространением инфекционных кишечных заболеваний, вызываемых энтеробактериями (Salmonella, Shigella, энтеропатогенными E. coli) и вибрионами (Vibrio cholerae). Недостаток средств не позволяет этим странам широко применять обычные способы вакцинации детей (нехватка вакцин, холодильных установок, медицинского оборудования и обученного медперсонала), поэтому вакцины орального применения оказались бы наиболее приемлемыми для таких стран. Именно с этой целью продолжается работа по созданию трансгенных “вакцинных” растений, которые можно употреблять в пищу в сыром виде, в частности, бананов.

Исследования конца 1990-х – начала 2000-х годов показали, что введение в пластидный геном генов бактериальных токсинов (холерного токсина, столбнячного токсина; генов, кодирующих поверхностные антигены бактерий (возбудителя чумы, возбудителя сибирской язвы), простейших (антиген дизентерийной амебы) и вирусов (ротавирусов животных и человека, вирусов гепатита) обеспечивает высокий уровень продукции этих белков трансформированными растениями, что открывает широкие возможности для применения их как в качестве «съедобных вакцин», так и своеобразных «биофабрик» для дешевых вакцин инъекционного введения. Учитывая возможности наработки вакцинных препаратов на основе вирусных экспрессионных векторов, описанные в разделе «Использование вирусов для генетической трансформации растений», можно говорить о начале новой эпохи в производстве вакцинных препаратов для борьбы с инфекционными болезнями.

Параллельно с этим направлением разрабатывается и получение вакцинных препаратов для борьбы с аллергическими заболеваниями. По некоторым данным около 30% населения экономически развитых стран в той или иной форме (аллергический ринит, аллергический конъюнктивит, сенная лихорадка, астма, пищевая аллергия, аллергия на бытовую пыль, аллергия на яды насекомых) страдают от проявления гиперчувствительности типа I.

Одним из путей лечения таких аллергий является создание выраженного иммунного ответа на аллерген, не связанного с продукцией IgE, либо индукция иммунотолерантности к этому аллергену. И того, и другого можно достичь, осуществляя контакт аллергена с организмом пациента, однако такая методика лечения должна осуществляться очень осторожно, так как она может привести к анафилактическому шоку, и далеко не всегда дает ожидаемый результат. Медикам известно, что на некоторые содержащиеся в пище антигены, а также на некоторые антигены микроорганизмов нормальной микробиоты желудочно-кишечного тракта естественным путем вырабатывается иммунотолерантность.

Считается, что этому способствует пролонгированный контакт иммунной системы слизистых оболочек (ИСС) с антигенами. Это и стало основанием для разработки трансгенных растений, содержащих антигенные детерминанты тех или иных аллергенов, в частности, содержащихся в пыльце некоторых растений.

Одним из примеров таких растений являются трансгенные линии риса, в зерновках которых содержатся так называемые Т-клеточные эпитопы пыльцы хвойных растений.

Получены эти линии японскими исследователями, поскольку в Японии около трети населения (26%) страдает аллергией на такую пыльцу.

Выбор именно Т-клеточных эпитопов не случаен: установлено, что вырабатывающие IgE В-клетки реагируют на одни антигенные детерминанты аллергена, а участвующие в развитии иммунного ответа Т-клетки – на другие. Упомянутые выше Тклеточные эпитопы являются короткими пептидами, которые должны связываться с рецепторами Т- клеток и приводить их тем самым к состоянию анергии, то есть делать их неактивными. Присоединиться же к находящимся на поверхности тучных клеток IgE и вызвать тем самым проявление аллергического состояния эти пептиды не могут. Таким образом, при употреблении содержащих такие пептиды рисовых зерен должен реализоваться безопасный путь развития толерантности к пыльцевым аллергенам.

Для создания первых линий таких рисовых растений были использованы пептиды из антигенов Cry 1и Cry 2 пыльцы японского кедра (Cryptomeria japonica). Кодирующие их последовательности были вставлены в высоко вариабельные регионы гена запасного белка сои глицинина A1aB1b, и такой модифицированный ген был поставлен под промотор гена глутелина риса GluB-1. Это обеспечивало правильную укладку белка в определенных участках эндосперма рисовых семян. Кормление такими семенами сенсибилизированных пыльцой японского кедра лабораторных мышей привело к ингибированию ТH2-зависимого иммунного ответа, приводящего к появлению IgE. Более того, у таких мышей снизилось количество индуцируемого пыльцой гистамина в крови и уменьшилось проявление связанного с действием пыльцы чихательного рефлекса (работа Takagi et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 2005, 102, 17525–17530).

Эта работа была продолжена, и к уже экспрессированным Т-клеточным эпитопам были добавлены еще несколько, поскольку у разных пациентов в Японии оказалась неодинаковая чувствительность к определенным эпитопам. Такой улучшенный вариант несущего эпитопы пептида получил название Crp7. Проверка риса, экспрессирующего Crp7, по описанной выше схеме показала такие же результаты, а затем к 2013 году уже этот вариант еще раз был улучшен введением еще одного несущего семь дополнительных эпитопов фрагмента Crp3 (Takaiwa and Yang, Transgenic Res. 2014, 23, 573–584).

Подобного рода работы японскими исследователями были проделаны и с антигенными детерминантами антигенов из фекалий клещей рода Dermatophagoides для создания риса, снижающего аллергию на домашнюю пыль. Кроме этого, используя полученную в 2007 году в университете г. Зальцбург (Австрия) информацию об эпитопах пыльцы березы, к 2014 году в лаборатории Фумио Такаивы были созданы линии трансгенного риса для борьбы и с этим вариантом сенной лихорадки.

Проводятся клинические испытания некоторых вариантов антиаллергического трансгенного риса, и в определенных правительственных структурах Японии прорабатывается вопрос о выдаче разрешения на выращивание таких сортов.

Помимо использования растений для получения вакцин, имеются предпосылки для разработки препаратов, пригодных для создания пассивного иммунитета. Здесь пионерной считается работа Julian Ma (Guy’s Hospital, London), Andrew Hiatt (Plant Biotechnology Department, San Diego, California), Mich Hein (Scripps Research Institute, La Jolla, California) и их соавторов из этих же учреждений. Целью этой работы было получение растений, способных продуцировать антитела в норме присутствующие в секретах слизистых оболочек ротовой полости. Сложность задачи состояла в том, что молекула секреторного иммуноглобулина состоит из 4-х различных белковых цепей (H-цепь, L-цепь, J-цепь и секреторный компонент), кодируемых различными нуклеотидными последовательностями. Для достижения своей цели исследователи создали четыре отдельных линии растений табака, продуцирующих один из необходимых белков.

Конкретно были использованы:

ген тяжелой цепи IgG1 мыши, клонированный из гибридом линии Guy’s 13, 1) дающей моноклональные антитела против антигена I/II Streptococcus mutans и Streptococcus sobrinus (этот антиген необходим стрептококкам для адгезии на поверхности зубной эмали);

ген легкой каппа-цепи из этих же гибридом;

2) ген J-цепи иммуноглобулинов мыши (был получен путем амплификации кДНК, 3) построенных на основе мРНК IgA-продуцирующих мышиных гибридом, с использованием синтетических N-концевых и C-концевых праймеров);

ген секреторного компонента IgA2 (получен путем амплификации кДНК, 4) построенных на основе мРНК белка-рецептора из клеток слизистой оболочки кролика, с использованием соответствующих синтетических N-концевых и Cконцевых праймеров).

Ген, кодирующий Н-цепь, был модифицирован путем замещения последовательности, соответствующей C3-домену на последовательности, соответствующие C2- и С3-доменам, взятые из клонированных из мышиных гибридом линии МОРС 315 генов (эти гибридомы продуцируют секреторный IgA). Такой «гибридный» V-С1-C2-C2-C3-ген был проверен на экспрессию в клетках растений табака, уже экспрессирующих легкие цепи, и оказалось, что обнаруживается белок с массой 210 кДа (тогда как у исходного IgG масса 190 кДа) и он действительно гибридный (проверено путем иммуноблотинга с антителами против IgG и антителами против JgA).

Это говорило о том, что замена конца тяжелой цепи не препятствовало ее синтезу, объединению с такой же тяжелой цепью и объединению с легкими цепями.

Все 4 гена под промотором 35S РНК CaMV были по отдельности вставлены в плазмиду pMON 530, эти плазмиды перенесены в клетки Agrobacterium tumefaciens, несущие плазмиду-помощник (система бинарных векторов), и этими агробактериями были обработаны изолированные клетки листьев табака.

После регенерации растений из изолированных клеток были получены четыре линии трансгенных растений. Каждая линия была «самофертилизирована» (т.е. подвергнута самоопылению) для перевода в состояние гомозиготности по введенным генам и затем было проведено скрещивание растений, несущих гены тяжелых и легких цепей.

Полученное гибридное потомство продуцировало IgG-IgA, состоящий из тяжелых и легких цепей. Теперь уже такое растение скрестили с растением, содержащим ген j-цепи.

Иммуноблотинг экстрактов из трансгенных растений с антителами к легким цепям иммуноглобулинов мыши (1-6) или к секреторному компоненту иммуноглобулинов IgА кролика (7-10)

–  –  –

Рис. 17. Получение секреторного иммуноглобулина IgA в трансгенных растениях (пояснения см. по тексту) В клетках такого гибридного потомства обнаруживался белок с массой около 400 кДа, соответствующей димеру, что показало наличие у синтезируемой в растении j-цепи способности связывать мономеры в димер. И на последнем этапе продуцирующее димеры растение скрестили с растением, несущим ген секреторного компонента. В клетках растений из такого скрещивания обнаруживались мономерные и димерные антитела, а также белки с массой около 470 кДа, что приблизительно соответствовало секреторному иммуноглобулину (верхний форез на рис. 17, полосы 1-6). Проверка экстрактов этих же клеток и экстрактов из клеток всех других вариантов с помощью специфичных к секреторному компоненту кроличьих антител показала, что секреторный компонент не связывается ни с какими другими белками, т.е. неспецифическое связывание отсутствует (полосы 7-10 на верхнем форезе).

Все исследуемые белки были проверены на «подлинность» (т.е. наличие именно этих составляющих) в экспериментах, где экстракты из листьев трансгенных растений подвергались частичной денатурации (так называемые «редуцирующие условия») (нижние левые форезы на рис. 17).

Кроме того, была проанализирована необходимость j-цепи для сборки секреторного иммуноглобулина (в организме млекопитающих без него секреторный иммуноглобулин не образуется). Для этого были проведены скрещивания растений, продуцирующих мономерный иммуноглобулин, с растениями, несущими ген секреторного компонента.

Анализ белков из клеток потомков такого скрещивания (форез внизу справа на рис. 17) показал, что без j-цепи не образуются ни димерные формы, ни какие-либо комплексы из секреторного компонента и иммуноглобулина.

Проверка функциональной способности продуцируемых в растениях антител показала, что все антитела (мономеры, димеры, секреторный иммуноглобулин) связывают очищенный антиген S. mutans и клетки данного вида стрептококка с такой же эффективностью, как и IgG из супернатанта гибридом Guy’s 13.

Оказалась, что сборка секреторного иммуноглобулина в растительных клетках происходит эффективно – около 50% синтезируемого секреторного компонента находится в комплексе с димерами и количество секреторного иммуноглобулина (до 500 мкг на грамм сырого веса) значительно больше, чем мономерного, вероятно из-за того, что секреторная форма более устойчива к протеолизу. Кроме того, в растительных клетках димеризация происходит лучше, чем в клетках насекомых – по данным Carayannopoulos et al. (1994) при экспрессии рекомбинантного IgA и j-цепи с бакуловирусных векторов только незначительная часть антител была димеризована, а в табаке 57% всех синтезированных в присутствии j-цепи антител являются димерами. Особенно важно, что получение именно секреторного иммуноглобулина А всегда связано с трудностями, их удавалось получать либо путем конъюгирования in vitro отдельно продуцируемых секреторного компонента и димерного иммуноглобулина, либо путем создания опухолей у лабораторных животных посредством введения в их организм гибридом, продуцирующих моноклональный IgA. Растения же дают полноценный моноклональный секреторный иммуноглобулин в значительных количествах. Предполагается, что нанесение таких иммуноглобулинов на поверхность слизистых оболочек будет давать еще больший защитный и лечебный эффект, который уже был продемонстрирован при использовании суспензий моноклональных противострептококковых IgG. Это вполне возможно, поскольку авидность у димерных форм выше и наличие в них секреторного компонента защищает их от протеолиза.

Данная работа была сделана с антителами против стрептококковых антигенов с целью получения препаратов для предотвращения кариеса (например, компонентов зубных паст), но демонстрация принципиальной схемы (использование полученных in vitro «гибридных» последовательностей, получение отдельных линий трансгенных растений и затем скрещивание их в определенных сочетаниях) и возможности самосборки и накопления в клетках растений одних из самых сложных по строению антител делает эту работу очень показательной.

Антитела могут быть использованы не только для терапии или профилактики инфекционных болезней, но и для терапии раковых заболеваний. Биотехнологическая фирма Agracetus Incorporated имеет трансгенную сою сорта BR96, дающую моноклональные антитела, специфичные к антигенам раковых клеток, и предполагается их использование для доставки химиотерапевтического препарата для лечения рака яичников, рака легких и рака толстой кишки доксорубицина непосредственно к клеткаммишеням. Посевы такой сои на опытных участках в Пуэрто-Рико проводятся уже с 1995 года.

Обсуждается еще одно возможное применение достижений генетической инженерии

– разработка методов контроля за рождаемостью. В работе Fitchen et al. (1994, “Vaccine”) сообщалось о получении гибридного вируса мозаики табака, у которого в оболочке присутствует небольшой фрагмент (13 аминокислот) белка из выделяемого яичниками мышей секрета, обволакивающего созревающие яйцеклетки. Введение суспензии такого вируса, размноженного в клетках растений, в кровь мышей приводило к выработке антител, специфичных к созревающим яйцеклеткам мыши.

При экспрессии генов, продукты которых имеют медицинское назначение, очень хорошо проявляет себя пластидная трансформация. Показана возможность получения с помощью интеграции генов в пластидный геном антител, интерферонов и, инсулиноподобного фактора роста, проинсулина, а также новой группы антибиотиков – кодируемых генами бактериофагов лизинов, способных разрушать клеточные стенки бактерий. Все эти вещества после соответствующей очистки могут быть использованы как медицинские препараты для внутреннего применения.

Перспективы использования трансгенных растений в медицинских целях обсуждают с позиций «за» и «против». За: вакцины и антитела, в отличие от получаемых из организмов или культур клеток животных, должны быть дешевле и безопасней в плане отсутствия в них плохо тестируемых вирусов. Против: получаемые в больших масштабах препараты для инъекций трудно очищать от алкалоидов и других токсических веществ растительного происхождения.

Трансгенные растения – будущее мирового сельского хозяйства Применение трансгенных растений в сельскохозяйственном производстве ведет отсчет с 1996 года. Лидером в выращивании генно-инженерных сортов по-прежнему являются США, но в настоящее время опережающими темпами в свое сельское хозяйство эти современные сорта внедряют развивающиеся страны. В 2014 году они опередили по площадям, занимаемым трансгенными растениями, индустриально-развитые страны (рис. 18).

Рис.18. Рост площадей, занятых трансгенными растениями, в странах с различным уровнем экономического развития (по данным ISAAA - International Service for the Acquisition of Agribiotech Applications, http://www.isaaa.org).

Этот факт как нельзя более наглядно демонстрирует преимущества трансгенных растений перед обычными – их выращивание оказывается более выгодным по сравнению с любыми из сортов, культивируемых ранее. Основными трансгенными культурами являются соя, кукуруза, хлопок и рапс (рис. 19), хорошо зарекомендовавшие себя сначала в Северной Америке, а затем и по всему миру. Это гербицидоустойчивые сорта, энтомоустойчивые сорта и сорта, сочетающие оба этих признака (рис. 20).

Рис. 19. Основные трансгенные культуры, выращиваемые в мире (по данным ISAAA) Рис. 20. Распространение трансгенных растений в зависимости от внесенного генно-инженерным путем хозяйственно-полезного признака (по данным ISAAA).

В странах, вставших на путь модернизации сельского хозяйства на основе трансгенных сортов растений, трансгенные сорта неуклонно вытесняют традиционные. И в целом в мировом сельском хозяйстве трансгенные соя и хлопок уже занимают более половины общих площадей выращивания этих культур (рис. 21).

Рис. 21. Соотношение по занимаемым площадям обычных (Conventional) и трансгенных (Biotech) сортов сои, хлопка, кукурузы и рапса (по данным ISAAA).

В настоящее время трансгенные растения выращивают на всех континентах, кроме Антарктиды. В 2014 году в этой сфере хозяйства было занято более 18 миллионов фермеров в 28 странах на площадях 181,5 миллиона гектаров, причем прирост по отношению к 2013 году составил около 4% или 6,3 миллиона гектаров (рис. 21). Среди этих 28 стран 19 перешли в разряд мега-агробиотехнологических государств – так условно называют страны, перешедшие порог в 50 000 гектаров, занятых под трансгенными растениями (рис. 22).

Какие именно трансгенные культуры предпочитают выращивать в той или иной стране видно из данных за 2014 год, представленных на рис. 23. В 2015 году в список начавших промышленное выращивание трансгенных растений стран добавился Вьетнам, где начато выращивание трансгенной кукурузы. Информация о количестве коммерческих сортов различных видов растений, допущенных в целом в мире к октябрю 2016 года, приведена на рис. 24.

Рис. 21. Распределение территорий выращивания трансгенных растений на карте мира и рост площадей по трансгенными культурами за период с 1996 по 2014 год (по данным ISAAA).

Рис. 22. Мега-агробиотехнологические страны на 2014 год (по данным ISAAA).

Рис. 23. Информационный плакат ISAAA о распределении трансгенных сельскозяйственных культур по странам мира по данным на 2014 год.

–  –  –

Проблема биобезопасности и ее решение Информация по этому разделу очень хорошо изложена в статье А.П. Ермишина «Государственное регулирование безопасности генно-инженерной деятельности в Республике Беларусь» (2006 год) и в разделе 3 изданного в 2011 году под эгидой Национального координационного центра биобезопасности учебного пособия С.Е. Дромашко и соавторов «Генетически модифицированные организмы и проблемы биобезопасности». Файлы, содержащие электронные варианты этих публикаций, находятся на сайте кафедры микробиологии биологического факультета БГУ.

Дрожжи как объект генетической инженерии Дрожжевые грибы являются одноклеточными существами, которые сравнимы с бактериями по простоте технологических приемов их культивирования, но в то же время являются эукариотическими организмами. Их клетки, подобно клеткам других эукариот, способны модифицировать белковые молекулы после их синтеза на рибосомах, что не характерно для бактериальных клеток. Посттрансляционные изменения белков в эукариотических клетках заключаются: 1) в отщеплении фрагмента полипетидной цепи от первоначально синтезируемого белка-предшественника, без чего некоторые молекулы не могут приобрести свойственную функционально активному белку конформацию; 2) в катализируемом дисульфидизомеразами образовании ковалентных связей на стадиях формирования третичной, а для некоторых белков и четвертичной структуры; 3) в специфическом гликозилировании путем присоединения углевода к остаткам серина или треонина (О-гликозилирование), или к остатку аспарагина (N-гликозилирование); 4) в присоединении к различным остаткам аминокислот других дополнительных молекул, здесь возможно фосфорилирование, сульфатирование, карбоксилирование, ацилирование, ацетилирование, миристилирование и пальмитоилирование. Хотя различные виды эукариот существенно различаются по характеру и способам посттрансляционных модификаций, некоторые из ферментных систем дрожжей достаточно сходны с таковыми животных, что и обуславливает преимущества дрожжевых клеток перед бактериальными в технологиях микробного производства белков высших организмов.

Несмотря на наличие характерной для грибов ригидной клеточной стенки, дрожжи при определенных условиях эффективно воспринимают экзогенные молекулы ДНК. В настоящее время разработаны методы получения и регенерации дрожжевых протопластов, трансформация которых мало чем отличается от стандартных методов трансформации бактерий. Кроме того, возможно введение ДНК в дрожжевые клетки при использовании ацетата лития, а в последнее время широкое применение получила электропорация.

Наиболее изученным в культуральном и физиологическом отношениях видом дрожжей являются пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae, что связано с долголетней практикой применения культур этого вида в биотехнологических процессах (хлебопечение и производство спирта). Генетический аппарат и особенности размножения этих грибов также детально изучены, а с 1996 года имеется полный сиквенс генома Saccharomyces cerevisiae. Наличие в клетках дрожжей не только хромосомной, но и плазмидной ДНК также улучшает возможности использования их для генно-инженерных целей. Кроме того, дрожжевые клетки, подобно бактериальным, обладают системами секреции белковых молекул, но эти системы являются эукариотическими, т.е. в процессе собственно секреции, как правило, осуществляются пострансляционные перестройки белка, что в некоторых случаях важно для получения активного генно-инженерного продукта. Существенно также то, что дрожжи выделяют в культуральную среду небольшое количество собственных белков, поэтому если добиться секреции чужеродного белка, очистка его происходит с меньшими трудностями.

Для введения в дрожжевые клетки стабильно наследуемой чужеродной генетической информации используют три основных подхода. Первый заключается в использовании системы автономной репликации природных дрожжевых плазмид, известных как 2 мкмплазмиды. Поскольку все основные манипуляции по комбинированию нужных последовательностей ДНК оптимально производить в клетках E. coli, получены стандартные дрожжевые вектора, включающие как обязательные компоненты сайты начала репликации в прокариотических клетках (oriV из pBR322), сайт инициации репликации в клетках дрожжей и селективный маркер для отбора трансформированных дрожжевых клеток. В качестве такого маркера, как правило, служит какой-либо дрожжевой ген биосинтеза той или иной аминокислоты (лейцина, гистидина, триптофана) или азотистого основания (урацила). Естественно, что в этом случае в качестве трансформируемых дрожжевых культур используют соответствующего мутанта, дефектного по такому же гену. Оба эти компонента вектора присутствуют во фрагменте 2мкм плазмиды дрожжей, лигированном с плазмидой pBR322. Селективным маркером для поддержания вектора в бактериальных клетках является ген ампициллинрезистентности из pBR322. Такой вектор успешно поддерживается как в клетках бактерий, так и в клетках дрожжей, то есть относится к векторам челночного типа. Вставка предназначенного для введения в дрожжевые клетки гена осуществляется по сайтам полилинкера pBR322. Такие челночного типа молекулы многократно использовались при введении в клетки генов животных и человека и известны в дрожжевой молекулярной генетике как эписомные экспрессирующие векторы. Приведенный на рис. 25 пример касается экспрессии гена человека (Cu/Zn-SOD) под промотором гена Cu/Zn-супероксиддисмутазы глицеральдегидфосфатдегидрогеназы дрожжей (GAPDp) и сайтом терминации\ полиаденилирования этого же гена (GAPDt). Этот фермент имеет медицинское применение: его вводят в орган, который на время хирургической операции был лишен кровоснабжения, с целью связывания супероксид-анионов, образующихся при повторной перфузии (т.е. вхождении в орган крови).

Рис. 25. Экспрессирующий вектор для дрожжевых клеток.

Однако при промышленном применении сконструированных таким образом штаммов выявился существенный недостаток – при длительном и масштабном (в емкостях более 10 литров) клетки начинают терять плазмиду. Поэтому на основе эписомных векторов были сделаны векторы, обеспечивающие встраивание вводимого фрагмента ДНК в ДНК дрожжевых хромосом, так называемые интегрирующие векторы.



Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Похожие работы:

«Федеральный арбитражный суд Дальневосточного округа Постановление № Ф03-5188/2011 03.04.2012 Резолютивная часть постановления объявлена 27 марта 2012 года. Полный текст постановления изготовлен 03 апреля 2012 года. Федеральный арбитражный суд Дальневосточного округа в составе: Председательствующего: О.В....»

«Зерновые культуры (Выращивание, уборка, доработка и использование) Учебно-практическое руководство Под общей редакцией доктора с.-х. наук, профессора, иностранного члена РАСХН Д. Шпаара 3-е издание, доработанное и дополненное ИД ООО "ДЛВ АГРОДЕЛО" Москва УДК 6...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФГБОУ ВПО "ТУВИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" КЫЗЫЛСКИЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ Кафедра педагогики и методики дошкольного и начального образования Роль театрал100€анных игр в экологическом воспита...»

«Дрюпина Екатерина Юрьевна МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РАСЧЕТА ДОПУСТИМЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ЗАГРЯЗНЯЮЩИХ ВЕЩЕСТВ В СТОЧНЫХ ВОДАХ ПРЕДПРИЯТИЙ ПРИ ОРГАНИЗАЦИИ ГОРОДСКИХ СИСТЕМ ВОДООТВЕДЕНИЯ (НА ПРИМЕРЕ Г. БАРНАУЛА) 25.00.27 – гидрология суши, водные ресурсы, гидрохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата техни...»

«Дидактические игры по познавательному развитию (экологическое воспитание) для детей старшей группы компенсирующей направленности Игра ведущий вид деятельности в дошкольном возрасте. Дидактическая игра – явление многоплановое, сложное. Это и метод обучения, и форма обучения, и самостоятельная игровая деятел...»

«ПОЛОЖЕНИЕ О ПРИМЕНЕНИИ МЕТОДОВ МАТЕМАТИЧЕСКОЙ СТАТИСТИКИ ДЛЯ УЧЕТА И КОНТРОЛЯ ЯДЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ РБ 066 11 проведение сертификации ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ЭКОЛОГИЧЕСКОМУ, ТЕХНОЛОГИЧЕСКОМУ И АТОМНОМУ НАДЗОРУ УТВЕРЖДЕНО приказ...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "КАРАЧАЕВО-ЧЕРКЕССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени У.Д. АЛИЕВА" Кафедра биологии и химии "Утверждено" на заседании кафедры био...»

«УДК 338.14 Вусов Александр Владимирович Vusov Alexandr Vladimirovich аспирант Московской финансово-промышленной PhD student, Moscow University академии МФПУ "Синергия", for Industry and Finance Synergy руководител...»

«РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА для написания раздела диплома "Мероприятия по охране труда и безопасности жизнедеятельности"Структура раздела и правила оформления диплома: 1. Дипломное проек...»

«ГРАЖДАНСКИЙ КОДЕКС РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Гражданский кодекс Российской Федерации часть 1. Федеральный закон от 30 ноября 1994 года № 51-ФЗ (текст по состоянию на 03.09.2015 г.) Глава 9. СДЕЛКИ...»

«BY9800127 Министерство по чрезвычайным ситуациям Республики Беларусь Институт радиобиологии Национальной академии наук Беларуси Основные итоги выполнения научного раздела Государственной программы Республики Беларусь по...»

«ПОВОЛЖСКИЙ ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2017. № 1. С. 14 – 23 УДК 575.174.015.3:599.323.4:591.9(470.62) К ВИДОВОМУ СОСТАВУ, РАСПРОСТРАНЕНИЮ И ЭКОЛОГИИ ПОЛЁВОК (MAMMALIA, CRICETIDAE, MICROTINA) СЕВЕРО-ЗАПАДНОГО КАВКАЗА А. Е. Балакирев 1, Т. А. Миронова 1, Л. А. Хляп 1, Л. Е Василенко 2, Н. М. Окулова...»

«175_15291982 АРБИТРАЖНЫЙ СУД ГОРОДА МОСКВЫ 115191, г.Москва, ул. Большая Тульская, д. 17 http://www.msk.arbitr.ru ОПРЕДЕЛЕНИЕ г. Москва Дело № А40-25661/15-175-160Б 03.03.2017. Резолютивная часть определения объявлена 14.02.2017. Полный текст определения изготовлен 03.03.2017. Арбитражны...»

«Научно – исследовательская работа ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА ШОКОЛАДА И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА ОРГАНИЗМ Выполнил: Бегоулев Даниил Олегович учащийся 9 класса МОУ "Средней общеобразовательной школы № 75", МО "Котлас", Архангельской области Руководитель учитель Овсянникова Ольга Георгиевна учитель хим...»

«ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 3 2012 СЕРЫЯ БІЯЛАГІЧНЫХ НАВУК УДК 579.22:582.28:66.081 В. В. ЩЕРБА, Т. А. ПУЧКОВА, Л. Т. МИШИН ОБРАЗОВАНИЕ СОЕДИНЕНИЙ ИНДОЛЬНОЙ ПРИРОДЫ СЪЕДОБНЫМИ И ЛЕКАРСТВЕННЫМИ ГР...»

«ЛЕОНОВ Вячеслав Сергеевич Разработка технологии производства субстанций терапевтических вакцин против заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека 6/11 и 16/18 типов 03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степен...»

«МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ по сопоставлению данных разведки и разработки месторождений твердых полезных ископаемых Москва, 2007 Разработаны Федеральным государственным учреждением "Государственной...»

«Биогазовые проекты в Украине. Финансируемые технологии. Киев, 24-25 марта 2011 Мазур Григорий Владиславович 61166 Украина г. Харьков ул. Новгородская 11, оф. 402 +38 057 752 30 74 +38 057 752 30 75 info@mnc.in.ua www.mnc.in.ua MNC certification MNC biogas MNC pure water MNC Kyoto Protocol MNC micro turbines Официальный Сотрудничес...»

«XXXVI Турнир имени М. В. Ломоносова 29 сентября 2013 года Задания. Решения. Комментарии Москва Издательство МЦНМО ББК 74.200.58 Т86 36-й Турнир имени М. В. Ломоносова 29 сентября 2013 года. Задания. Решения. Комментарии / Сост. А. К. Кулыгин. — М.: МЦНМО, 2015. — 187 с.: ил. Приводятся условия и решения заданий Турнира с подробным...»

«Научный журнал “Экономика Украины”. — 2015. — 7 (636) ПРОБЛЕМЫ ЭКОНОМИЧЕСКОЙ ТЕОРИИ УДК 368:63(477.42) А. Н. В И Л Е Н Ч У К, доцент, кандидат экономических наук, докторант, доцент кафедры финансов и кредита Житомирского национального а...»

«Инструкция по применению лечебной грязи "Сестрорецкая" Лечебная грязь "Сестрорецкая" является уникальным природным образованием, которое было сформировано около 6 тысяч лет назад на дне древнего водоема. Грязь "Сестрорецкая" представляет собой...»

«Министерство здравоохранения Российской Федерации Федеральное медико-биологическое агентство ФГБУ НИИДИ ФМБА России Северо-Западное отделение РАМН Комитет по здравоохранению Правительства Санкт-Петербурга Комитет по науке и высшей школе Правительства Санкт-Петербурга ГБОУ В...»

«А А У К Алексей Иванович ЛНШВ УДК 564.53:551.763.13'3(09){571.6) ЗАКОНОМЕРНОСТИ ИСТОРИЧЕСКОГО РАЗВИТИЯ АЛЬБСКИХ И Р Н Е Е О А С И А М Н И Е (DESMOCERATACEAE А Н С В М Н К Х М О О ДЙ И НОРЫТАСЕАЕ ) СЕВЕРО-ВОСТОКА. СССР 04.00.09 палеонтология х стратиграфия Автореферат диссертации на соискание ученой...»










 
2017 www.book.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.