WWW.BOOK.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные ресурсы
 
s

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

«Трансгенные эукариотические организмы курс лекций Минск БГУ Александр Георгиевич Песнякевич, кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии. Курс лекций разработан для биологического ...»

-- [ Страница 1 ] --

А. Г. Песнякевич

Трансгенные

эукариотические

организмы

курс лекций

Минск

БГУ

Александр Георгиевич Песнякевич,

кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии.

Курс лекций разработан для биологического факультета

Белорусского государственного университета

ТРАНСГЕННЫЕ ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ ОРГАНИЗМЫ, © 2017

Убедительная просьба – в случае обнаружения ошибки или неточности в тексте –

сообщите о ней администратору сайта bio.bsu.by через форму обратной связи.

Электронная версия от 12.04.2017 г.

Оглавление Введение

Получение и применение трансгенных растений

Естественная трансформация растений бактериями рода Agrobacterium

Изучение структуры и функций агробактериальных плазмид

Агробактериальные векторные системы для получения трансгенных растений

Получение трансгенных растений методом агроинфекции

Использование вирусов для генетической трансформации растений

Генетические конструкции для введения генетической информации в ДНК пластид.............. 47 Методы введения ДНК в растительные клетки

Получение трансгенных растений для сельскохозяйственного использования

Трансгенные растения, устойчивые к гербицидам

Трансгенные растения, устойчивые к насекомым-вредителям

Трансгенные растения, устойчивые к болезням

Трансгенные растения, устойчивые к неблагоприятным факторам среды

Трансгенные растения с улучшенными вкусовыми и товарными качествами

Трансгенные растения с улучшенной пищевой и промышленной ценностью

Трансгенные растения как источник медицинских препаратов

Трансгенные растения – будущее мирового сельского хозяйства

Проблема биобезопасности и ее решение

Дрожжи как объект генетической инженерии

Культуры клеток насекомых как объект генетической инженерии

Трансфекция клеток млекопитающих

Получение трансгенных животных

Современные методы редактирования геномов: перспективы и возможные последствия......... 152 TALEN-опосредованные генно-инженерные системы

Генно-инженерные системы на основе CRISPR/Cas9

Введение Предлагаемый вашему вниманию курс «Трансгенные эукариотические организмы» включает сведения об истории возникновения и развития одного из самых современных и перспективных направлений деятельности человечества – генетической инженерии. Особенностью этого направления является поразительно быстрый переход от научных изысканий к практическому использованию их результатов – к осуществляемому человеком направленному изменению наследственных признаков организмов. При этом следует подчеркнуть отраженный в названии курса принципиально новый методический подход, используемый в такой деятельности.

Как известно, осуществляемое под воздействием человека изменение свойств организмов началось во времена перехода первобытного человека от охоты и собирательства к выращиванию растений и разведению животных для удовлетворения собственных нужд. Проводимый в течение нескольких тысячелетий бессознательный искусственный отбор привел к появлению культурных растений и домашних животных, отличающихся от своих диких предков наличием хозяйственно-полезных признаков.

Затем возникший в результате развития наук методический искусственный отбор дал к середине 20-го века огромное многообразие сортов и пород, но все эти отобранные человеком варианты являлись лишь закреплением в рядах поколений изначально создаваемых природой свойств.





Даже мутагенез и межвидовые скрещивания, осуществляемые в ходе селекционной работы до середины 20-го века, по сути своей лишь условно могли быть признаны методиками, создающими принципиально новые, нехарактерные для исходных организмов признаки и комбинации признаков. И только с появлением технологии получения рекомбинантных ДНК и разработкой методов их введения в наследственный материал различных организмов такой методический подход получил реальное воплощение.

Основанием для создания и реализации такого подхода стали доказательства роли нуклеиновых кислот, как носителей генетической информации, выяснение принципов ее кодирования и экспрессии в клетках живых организмов, разработка методик манипулирования с нуклеиновыми кислотами. Фактически, за 20 лет, с момента опубликования работы Дж. Уотсона и Ф. Крика (1953 год), в которой описывалась структура молекулы ДНК, до опубликования работ Стэнли Коена и его коллег (1973 год), сообщавших о направленном получении молекул ДНК, объединяющих фрагменты нуклеиновых кислот бактерий и вируса обезьян, молекулярная биология прошла путь от чисто теоретической науки до технологии, получившей название генетическая инженерия.

Примечательно, что те, кто создавал методики объединения нуклеиновых кислот для решения чисто научных проблем, сумели за короткое время увидеть в них основы для производства веществ, необходимых в различных сферах практической деятельности человека. Это привело к тому, что поначалу условное название генетическая инженерия наполнилось истинно инженерным содержанием: подобно тому, как инженеры создают механические устройства для производства того или иного продукта, специалисты в области биотехнологии начали создавать для этих целей организмы. Одним из ярких примеров развития прикладного аспекта молекулярной биологии может быть судьба Герберта Бойера – одного из соавторов Стенли Коена. В 1976 году (через три года после опубликования положившей начало генетической инженерии работы) Герберт Бойер основал всемирно известную фирму Genentech, Inc. (полное название Genetic Engineering Technology, Inc.), которая к 1980 году сделала его миллионером, а к 2008 году эта биотехнологическая корпорация насчитывала 11 тысяч сотрудников и имела чистую годовую прибыль в объеме 3,64 миллиарда долларов США.

Практическое применение генетической инженерии началось с использования генетически измененных прокариотических организмов, но к началу 80-х годов двадцатого века были получены первые генетически модифицированные с помощью рекомбинантных технологий растения. Именно такие эукариотические организмы получили название трансгенных, то есть полученных путем направленного переноса в их хромосомы генов других организмов (от англ. слов transfer – перенос и gene – ген).

Получение и применение трансгенных растений Основанием для разработки основного метода получения трансгенных растений стало открытие в 1977 году ранее неизвестного варианта симбиотических отношений, получившего название генетическая колонизация хозяина. Такой способ взаимодействия со своими хозяевами осуществляют бактерии рода Agrobacterium, вызывающие заболевания растений из класса Двудольные. Именно они, единственные из известных организмов, способны осуществлять естественным путем трансформацию растительных клеток путем введения в их хромосомы специальных фрагментов ДНК. Поскольку используемая в генетической инженерии технология основана на этом уникальном природном явлении, стоит рассмотреть этот феномен подробнее.

Естественная трансформация растений бактериями рода Agrobacterium Одним из вариантов патологических изменений растений являются галлы – утолщения, развивающиеся на тех или иных органах растения под воздействием факторов среды. Фитопатологам известно более 15 тысяч различных видов галлов, различающихся по расположению на растении, форме, цвету, размерам и внутреннему строению. В большинстве случаев подобные разрастания растительной ткани связаны с неконтролируемым растением делением клеток, причиной которого является проникновение под покровные ткани растения различных организмов. Появление галлов может быть вызвано присутствием животных (клещи, насекомые, нематоды) или микроорганизмов (грибы, бактерии, вирусы).

Инфицирование растений представителями рода Agrobacterium также приводит к развитию опухолеподобных образований. Известны три связанных с этими бактериями заболевания. Наиболее распространенным из них является так называемый корончатый галл, представляющий собой утолщение стебля в районе корневой шейки. Возбудитель корончатого галла был описан в 1907 году Смитом и Таусендом, которые получили чистую культуру присутствующих в опухоли бактерий и подтвердили их патогенность путем введения чистой культуры в растения. Опираясь на симптомы вызываемого заболевания, они дали выделенным бактериям название Bacteruim tumefaciens, то есть опухолеобразующие. Впоследствии этот вид в ходе неоднократного уточнения систематического положения переименовывался сначала в Pseudomonas tumefaciens, затем в Phytomonas tumefaciens и, в конце концов, в Agrobacterium tumefaciens (Smith et Town.) Conn.

Еще одно связанное с агробактериями заболевание называется бородатый корень.

Его возбудителем является Agrobacterium rhizogenes, вызывающий утолщение корней растений из класса Двудольные. При развитии этого заболевания на сильно утолщенном главном корне стержневой корневой системы образуется множество укороченных недоразвитых боковых корней, что и послужило основанием для наименования болезни.

Третий вид из рода Agrobacterium, названный Agrobacterium rubi, вызывает утолщения на боковых побегах пораженных растений, так называемые стеблевые галлы.

Помимо трех упомянутых фитопатогенных видов в род Agrobacterium входит и вид, постоянно обитающий в почве и ведущий сапротрофный образ жизни. Этот вид называется Agrobacterium radiobacter.

(Внимание! В 2001 году на основании сравнения последовательностей гена 16S рибосомальной РНК род Agrobacterium и входящие в него виды перенесены в род Rhizobium. [J M Young, L D Kuykendall, E Martnez-Romero, A Kerr and H Sawada A revision of Rhizobium Frank 1889, with an emended description of the genus, and the inclusion of all species of Agrobacterium Conn 1942 and Allorhizobium undicola de Lajudie et al. 1998 as new combinations: Rhizobium radiobacter, R. rhizogenes, R. rubi, R. undicola and R. vitis. // Int. J.

Syst. Evol. Microbiol. – 2001. - vol. 51, January no. 1. – p. 89-103]. Вид Agrobacterium tumefaciens в современной систематике не существует, вместо него имеется вид Rhizobium radiobacter, бактерии которого при наличии в клетках Ti-плазмиды способны индуцировать развитие корончатого галла на растении. Несмотря на это в литературе по генетической инженерии и в базах данных по геномам микроорганизмов используется устоявшееся старое называние Agrobacterium tumefaciens. Ряд исследователей настаивают на сохранении рода Agrobacterium, так что этот вопрос до сих пор остается спорным.

В данном курсе лекций также будет использоваться старое название этого вида бактерий).

Бактерии всех четырех видов морфологически сходны и представляют собой грамотрицательные палочки 1 – 3 мкм длиной и 0,6 – 1 мкм шириной, имеют 2 – 6 жгутиков, расположенных перетрихиально. Аэробы, могут образовывать небольшую капсулу. Местом обитания для патогенных видов являются индуцируемые ими галлы на растениях класса Двудольные, но при отсутствии растения-хозяина эти бактерии способны сохранять жизнеспособность на растительных остатках в почве в течение нескольких лет. Большинство штаммов прототрофны, хорошо культивируются на минимальных питательных средах с сахарами в качестве источника углерода, но для некоторых природных штаммов факторами роста являются витамины, в частности пантотеновая и никотиновая кислоты.

Отличительной чертой большинства природных штаммов Agrobacterium tumefaciens является отсутствие выраженной хозяйской специфичности, свойственной большинству других бактериальных фитопатогенов. Выделенные из пораженных растений конкретного вида Agrobacterium tumefaciens способны вызывать развитие опухоли у представителей практически всех семейств из класса Двудольные. Инфицирование агробактериями растений из класса Однодольные в естественных условиях не происходит, что предположительно объясняется отсутствием на клетках однодольных растений сайтов специфического прикрепления агробактерий и неспособностью этих растений образовывать один из наиболее важных индукторов процесса агробактериальной трансформации растительных клеток – ацетосирингон.

Еще одно отличие представителей рода Agrobacterium от множества других патогенных микроорганизмов – это отсутствие у них факторов патогенности повреждающего действия. Эти бактерии не выделяют в окружающую среду пекто- и целлюлолитические ферменты, способные эффективно разрушать клеточные стенки растительных клеток. Кроме того, они не способны инфицировать растение путем проникновения через естественные отверстия в покровных тканях растений - устьица или гидатоды. Входными воротами для этих бактерий могут служить только травматические повреждения растительных тканей, сопровождающиеся выделением так называемого раневого сока – жидкости, вытекающей из механически разрушенных клеток.

Дикорастущие растения поражаются при попадании бактерий на раневые поверхности, возникающие при повреждении растения насекомыми или их личинками, а сельскохозяйственные – и при повреждениях растения в ходе агротехнических мероприятий.

Несмотря на различия в морфологии и расположении вызываемых агробактериями разных видов разрастаний растительной ткани, все они отличаются от вызываемых другими бактериями опухолей так называемым неограниченным ростом. Галлы, развивающиеся под воздействием других организмов, перестают увеличиваться в размерах после удаления вызвавшего их появления фактора, а корончатый галл, бородатый корень и стеблевой галл сохраняют способность к росту и после исчезновения из этих опухолей бактерий.

Более того, изолированные из таких опухолей растительные клетки продолжают делиться на питательных средах, не содержащих фитогормонов, что поначалу послужило основанием для появления такого термина, как гормоннезависимый рост. Здесь необходимо напомнить, что рост и развитие растения и его отдельных органов регулируется путем образования и распространения по растению определенных химических веществ. Так называемые ингибиторы роста (абсцизовая кислота, кумарин и др.) тормозят процессы деления и определяют переход растений в состояние покоя, тогда как фитогормоны (ауксины, цитокинины и гиббереллины) являются обязательными факторами деления клеток. Другими словами говоря, растительные клетки делиться без воздействия на них соответствующих фитогормонов не могут. Поэтому термин гормоннезависимый рост не следует понимать буквально, что и подтвердили проведенные в 60-70-х годах двадцатого века биохимические исследования тканей корончатых галлов и полученных из таких опухолей культур клеток. Оказалось, что в вызванных Agrobacterium tumefaciens опухолях присутствуют ауксин индолилуксусная кислота (ИУК) и цитокинин трансзеатин. В частности, в индуцированной штаммом В6 Agrobacterium tumefaciens опухоли на растении катарантус розовый (барвинок розовый) количество ИУК в 16 раз превышало таковое в здоровой ткани, а количество цитокининов трансзеатинового типа было увеличенным более чем в 100 раз. Причем такое же превышение было отмечено и в так называемых стерильных галлах, то есть таких, в которых вызвавшие развитие опухоли бактерии уже отсутствовали. Культивирование изолированных из этих опухолей клеток окончательно подтвердило, что клетки корончатых галлов, в отличие от обычных паренхиматических клеток растения, постоянно продуцируют значительные количества фитогормонов. Из этого следовало, что воздействие агробактерий на клетки растенияхозяина приводит к стабильному изменению процессов жизнедеятельности, которое является наследственно закрепленным.

Биохимические исследования корончатых галлов привели к обнаружению еще одного уникального свойства – клетки опухоли синтезируют и выделяют в окружающую среду особые вещества, получившие название опины. Первые сведения о наличии в опухолях необычных для растительных клеток продуктов метаболизма были получены в 1956 году, а с 1960 года началось их интенсивное изучение. Основные работы по выяснению химической структуры опинов в те годы проводились в Национальном институте агрохимических исследований в Версале (Франция) под руководством Жоржа Мореля. В его лаборатории было установлено, что химическая структура опина определяется не растением, а вызывающими опухоль бактериями – при заражении одним и тем же штаммом Agrobacterium tumefaciens различных видов растений в опухолях обнаруживали одинаковый опин. Более того, каждый определяющий продукцию того или иного опина штамм использовал именно этот опин в качестве источника азота и углерода.

В то же время растительные клетки использовать такие соединения в своем обмене веществ не способны.

По химической природе большинство опинов являются производными аминокислот, к которым в реакциях конденсации присоединяются либо кетокислота, либо сахар. Этот класс опинов разделяется на три основных семейства.

Опины, в которых неаминокислотный компонент представляет собой пируват, составляют октопиновое семейство. В него входят октопин [N2-(D-1-карбоксиэтил)- Lаргинин], октопиновая кислота [N2-(D-1-карбоксиэтил)-L-орнитин], лизопин [N2-(D-1карбоксиэтил)-L-лизин], гистопин [N2-(D-1-карбоксиэтил)-L-гистидин]. Интересен тот факт, что октопин, как химическое соединение, впервые был обнаружен в 1927 году в мышцах осьминога, что и дало ему название.

Нопалиновое семейство составляют производные аминокислот и альфакетоглютарата. Наиболее часто из этого семейства в опухолях встречаются нопалин [N2дикарбоксипропил)- L-аргинин] и нопалиновая кислота [N2-(1,3-дикарбоксипропил)L-орнитин]. Нопалиновая кислота имеет еще два названия – орниталин и орналин, которые используются как синонимы. Несколько реже в корончатых галлах обнаруживаются лейцинопин [N2-(1,3-дикарбоксипропил)-L-лейцин], глютаминопин [N2и аспарагинопин (его второе название (1,3-дикарбоксипропил)-L-глютамин] сукцинамопин), который представляет собой N-(3-амино-1-карбокси-3-оксипропил) глютаминовую кислоту.

Третье семейство опинов называется агропиновое и в него входят производные аминокислот, включающие маннозу, из-за чего это семейство также называют маннитиловым. Давший название семейству агропин представляет собой 1'-дезокси-Dманнитол-1'-ил)-L-глютамин-1',2'-лактон. В это же семейство входят агропиновая кислота, представляющая собой N-1-(D-маннитил)-лактам L-глютаминовой кислоты, а также маннопин [N-1-(D-маннитил)-L-глютамин] и маннопиновая кислота [N-1-(D-маннитил)-Lглютаминовая кислота].

Следует отметить, что называемые опинами производные аминокислот являются редко встречающимися природными соединениями. Всего известно около 30 опинов, причем некоторые из них обнаруживаются только в индуцируемых агробактериями опухолях. Помимо уже упомянутых в трех предшествующих абзацах к таковым относятся хризопин (обнаружен в корончатых галлах хризантем и фигового дерева), кукумопин (обнаружен в корончатом галле винограда и бородатом корне моркови), микимопин (4эпимерпроизводное кукумопина, обнаруженное в корончатом галле табака), гелиопин (его второе название – витопин), метиопин, ридеопин, сантопин (изредка обнаруживаются в корончатых галлах на различных видах растений). Известны и опины, не выявляемые в индуцированных агробактериями опухолях: аланопин, тауропин (встречаются в тканях некоторых видов морских беспозвоночных), эпилейцинопин, изолейцинопин, валинопин, фенилаланинопин (обнаружены в клетках ядовитого гриба Clitocybe acromelalga), стромбин (выделяется морским брюхоногим моллюском из рода Strombus). Еще одно соединение – сахаропин (эпсилон-N-(L-глютар-2-ил)-L-лизин) является одним из промежуточных продуктов метаболизма лизина у грибов, высших растений и млекопитающих, включая человека, но он не накапливается в тканях в норме.

Кроме опинов, являющихся производными аминокислот, в большинстве вызываемых агробактериями опухолей обнаруживаются необычные производные сахаров, которые называются агроцинопины. Все они представляют собой фосфодиэфиры монои дисахаридов. Известно четыре разновидности агроцинопинов, обозначаемых буквами от А до D. Агроцинопин А – это фосфодиэфир сахарозы и L-арабинозы, агроцинопин В – фосфодиэфир фруктозы и L-арабинозы, агроцинопин С - фосфодиэфир сахарозы и Dглюкозы, агроцинопин D – фосфодиэфир двух молекул D-глюкозы. Образование опинов этой группы также является специфичным. Как правило, агроцинопины А и В обнаруживаются в опухолях совместно с опинами нопалинового семейства, тогда как агроцинопины С и D – агропинового. Эти вещества также используются бактериями, вызывающими образование опухоли, в качестве источников углерода и энергии.

Утилизация опинов агробактериями осуществляется за счет наличия у них специализированных белков, обеспечивающих транспорт опина в бактериальную клетку и затем гидролиз их до обычных соединений, которые используются в общих путях метаболизма бактериальной клетки. Например, для использования октопина у конкретных штаммов агробактерий имеются октопинпермеаза и октопиноксидаза, синтез которых индуцируется октопином и другими опинами этого семейства.

То, что опины являются очень редко встречающимися в природе химическими соединениями, в какой-то мере объясняет отсутствие у большинства других микроорганизмов систем поглощения и утилизации этих веществ. Кроме агробактерий использовать опины могут лишь некоторые представители из группы флюоресцирующих псевдомонад, которые иногда обнаруживаются в корончатых галлах совместно с агробактериями. И это еще раз подчеркивает уникальность осуществляемого агробактериями паразитизма. Эти бактерии, колонизируя хозяина, не просто используют его ресурсы, а перестраивают его метаболизм на образование специальных пищевых веществ, в использовании которых они имеют явное преимущество перед множеством остальных микроорганизмов. Тем самым они, фактически, создают внутри индуцированных ими опухолей специфическую экологическую нишу, в которой нет подходящих условий для обитания популяций других видов и, следовательно, нет конкуренции с их стороны.

Выяснение того, каким же образом агробактерии перестраивают обмен веществ растительной клетки, имеет свою историю. Еще в 40-х годах 20 века сотрудник Рокфеллеровского института медицинских исследований Армин Браун (A. C. Braun), работая над изучением корончатых галлов растений как своеобразной модели злокачественных образований у животных и человека, предположил, что агробактерии (тогда они еще назывались Phytomonas tumefaciens) вводят в клетки хозяина некий гипотетический опухолеиндуцирующий фактор и назвал его TIP (tumor inducing principle).

С целью идентификации этого фактора ставились эксперименты, в которых для обработки растений использовались различного рода экстракты агробактериальных клеток, но формирование опухолей наблюдалось только тогда, когда использовались жизнеспособные бактерии. Параллельно делались попытки обнаружить в опухолевых клетках специфические белки, а затем и нуклеиновые кислоты, отсутствующие в нормальных клетках тех же самых видов растений, однако опухолеиндуцирующий фактор так и оставался гипотетическим до середины 70-х годов 20 века.

Ключевым моментом в идентификации TIP стали опубликованные в 1969 и 1971 году работы австралийского фитопатолога Аллена Керра и работа американских исследователей из Пенсильванского университета Гамильтона и Фолла. Керр сообщил о переносе признака опухолеобразования от вирулентного штамма Agrobacterium tumefaciens к невирулентному при их совмещении в корончатом галле, а Гамильтон и Фолл привели данные об утрате признака опухолеобразования бактериями штамма Agrobacterium tumefaciens С58 при выращивании их при непермиссивной температуре 36°С. Эти факты указывали на возможную плазмидную локализацию генов, отвечающих за признак опухолеобразования, что в короткое время и было подтверждено в трех основных лабораториях, которые лидировали в то время в изучении возбудителей корончатого галла. При исследовании имеющихся в этих лабораториях штаммов почти одновременно в Гентском университете в Бельгии, в Лейденском университете в Нидерландах и в Вашингтонском университете в США во всех вирулентных штаммах были обнаружены кольцевые ковалентнозамкнутые ДНК с массой от 112 до 156 мегадальтон. Удаление этих плазмид из клеток агробактерий с помощью различных элиминирующих факторов по всех случаях приводило к потере вирулентности, т.е. к отсутствию способности вызывать опухоли. Эти сведения о плазмидах Agrobacterium tumefaciens из разных штаммов были обобщены на симпозиуме в Бельгии уже в 1973 году, что и дало таким плазмидам название Ti-плазмиды от английского tumor inducing – опухолеиндуцирующие. Таким образом гипотетический TIP Армина Брауна начал обретать реальное воплощение. Теперь только оставалось доказать, что именно Tiплазмиды превращают обычные клетки растений в опухолевые. Первыми это сумели сделать сотрудники профессора Нестера в Вашингтонском университете.

Для обнаружения ДНК Ti-плазмиды в клетках корончатого галла в группе Нестера использовали различные подходы, но положительные результаты удалось получить при сравнении скорости ренатурации плазмидной ДНК в присутствии и отсутствии ДНК опухолевых клеток. Известно, что двунитевые молекулы ДНК при повышении температуры до 100°С разделяются на однонитевые (денатурируют), которые при охлаждении смеси до 63°С вновь объединяются в двунитевые молекулы (ренатурируют), при этом скорость ренатурации пропорциональна квадрату концентрации присутствующих в смеси молекул. Логическая схема эксперимента была следующей: если в выделенной из опухолевых растительных клеток ДНК присутствует ДНК плазмиды, скорость ренатурации должна быть большей.

Для постановки экспериментов Мэри-Дейл Чилтон и ее коллеги использовали меченную изотопом фосфора Р32 ДНК плазмиды рТіВ6-806; ДНК из обычных каллусных клеток табака; ДНК из линии опухолевых клеток табака, полученной из опухоли, индуцированной Agrobacterium tumefaciens с плазмидой рТіВ6-806 и ДНК лосося в качестве контроля. Достоверное превышение скорости ренатурации плазмидной ДНК было зафиксировано только для смеси ДНК плазмиды и ДНК из опухолевых клеток, но оно было небольшим. Одним из возможных объяснений этому стало предположение, что в ДНК опухолевых клеток присутствует не вся плазмидная ДНК, а лишь небольшая ее часть. Для подтверждения этого предположения плазмидную ДНК подвергли обработке рестриктазой SmaI, в результате чего было получено 19 фрагментов. Фрагменты были разделены с помощью электрофореза, элюированы из геля и с каждым из них проведены эксперименты по определению скорости ренатурации в присутствии ДНК из опухолевых клеток. Хорошо выраженное превышение скорости ренатурации было установлено для SmaI-фрагментов 3b и 10с. Дополнительные эксперименты с фрагментом 3b показали, что в ДНК опухолевых клеток обнаруживается последовательность, составляющая около 40% от длины SmaI-фрагмента 3b, что соответствует 3,7 106 дальтон, и количество копий этого фрагмента в одном диплоидном геноме опухолевых клеток табака равно 18.

Результаты этой работы были опубликованы в июньском номере журнала «Cell»

1977 года, и эта дата считается датой открытия феномена естественной генетической трансформации растений агробактериями. За короткое время уже с использованием метода гибридизации меченой ДНК по методу Саузерна в нескольких лабораториях на других штаммах агробактерий были получены подтверждения переноса ДНК в геном растительных клеток, и было установлено, какая именно часть ДНК Ti-плазмид переносится. Этот фрагмент получил название Т-ДНК от английского transfer DNA – переносимая ДНК. Фактически на этом и завершились поиски гипотетического TIP Армина Брауна – к концу 1970-х годов было доказано, что он представляет собой Т-ДНК.

Изучение структуры и функций агробактериальных плазмид Интенсивное изучение плазмид из различных штаммов Agrobacterium tumefaciens позволило установить общие черты в их строении и одновременно выявить различия, легшие в основу их классификации.

Первоначально плазмиды разделили по присущим штаммам агробактерий фенотипическим признакам, связанным с особенностями формирующихся на растении опухолей. Вызываемые разными штаммами корончатые галлы различаются по морфологии и по содержанию конкретных опинов.

На основании морфологических признаков различают три основных варианта корончатого галла. Первый из них - это шероховатые опухоли. Для них характерны округлая форма и наличие на поверхности небольших по размерам утолщений, из которых развиваются укороченные придаточные корни. Второй вариант называется гладкие опухоли, так как на их поверхности не формируются придаточные корни, а имеются небольшого размера выступы, напоминающие сильно утолщенные и укороченные листья. Внутри и шероховатые, и гладкие опухоли представляют собой однородную массу паренхиматических клеток. Третий вариант корончатого галла – это так называемые тератомы (уродства). Поверхность таких опухолей, как правило, не отличается от поверхности исходного здорового стебля, но внутри них наблюдается неупорядоченное смешение тканей, формирующееся из недоразвитых побегов, корней или листьев.

По биохимическому критерию корончатые галлы делят согласно наличию опинов того или иного семейства. Поскольку этот критерий является более однозначным и полностью зависит от локализованных на плазмидах генов, он и лег в основу названия групп Ti-плазмид.

Большинство обнаруженных в природных штаммах Ti-плазмид попадают в три основные группы. Первая группа – это плазмиды октопинового типа (октопиновые плазмиды). При инфицировании растений штаммами с плазмидами этой группы развиваются шероховатые опухоли, клетки которых продуцируют опины октопинового и агропинового семейств. Вторую группу составляют плазмиды нопалинового типа (нопалиновые плазмиды), обеспечивающие образование гладких опухолей (реже – тератом), в которых обнаруживаются опины нопалинового семейства, а также агроцинопины А и В. В третью группу – плазмиды агропинового типа (агропиновые плазмиды) – вошли плазмиды, определяющие образование корончатых галлов с различной поверхностью, но без придаточных корней, в которых синтезируются опины агропинового семейства и агроцинопины D и С. Опухоли, вызванные штаммами с плазмидами этой группы, отличаются более выраженным отмиранием клеток в центральной части.

Анализ плазмид, обнаруженных в клетках другого вида агробактерий Agrobacterium rhizogenes, показал, что они так же, как и плазмиды Agrobacterium tumefaciens, определяют способность агробактерий вызывать бородатый корень посредством введения в растительный геном небольшого фрагмента плазмидной ДНК и в целом по структуре и набору расположенных на них генов близки к Ti-плазмидам.

Но для того, чтобы подчеркнуть их происхождение, эти плазмиды традиционно называют Ri (от англ. root inducing), а не Ti, как плазмиды, выделенные из клеток Agrobacterium tumefaciens. Особых различий в морфологии вызываемых различными штаммами Agrobacterium rhizogenes опухолей не наблюдается, но по наличию опинов в индуцируемых ими опухолях Riплазмиды разделили на два типа. Клетки бородатого корня, вызываемого штаммами с Riплазмидами агропинового типа, продуцируют опины агропинового семейства и агроцинопин А. Штаммы с Ri-плазмидами маннопинового типа дают опухоли с продукцией маннопина, маннопиновой кислоты, агропиновой кислоты и агроцинопина С.

Одним из критериев классификации бактериальных плазмид является их принадлежность к определенной группе несовместимости. Учитывая то, что и Ti-, и Riплазмиды способны к конъюгативному переносу, но не способны реплицироваться в клетках других видов бактерий, за исключением видов рода Rhizobium, определение их несовместимости проводили не в клетках Е. coli, а в клетках Agrobacterium. Поэтому для их классификации по этому критерию были созданы новые группы несовместимости, названные Rh. В группу несовместимости IncRh-1 вошли все октопиновые и нопалиновые плазмиды, в группу несовместимости IncRh-2 – Ti-плазмиды агропинового типа, в группу IncRh-3 – Ri-плазмиды обоих типов.

Сопоставление данных рестрикционного и функционального картирования ряда Tiплазмид октопинового и нопалинового типов, полученных в период с 1975 по 1982 годы в различных лабораториях мира, показало, с одной стороны, правомочность предложенного разделения плазмид на группы, но, с другой стороны, позволило установить общие черты строения агробактериальных плазмид. В ходе построения физических (рестрикционных) карт изучаемых плазмид были выявлены 4 области гомологии, обозначенные первоначально латинскими буквами А, B, C и D (рис. 1).

Рис.1. Схемы строения Ti-плазмид октопинового и нопалинового типов.

Выяснение функций расположенных в этих областях генов подтвердило, что эти области действительно являются сходными в плазмидах, выделенных из штаммов агробактерий в различных географических регионах. Это позволило выдвинуть предположение о возможном происхождении всех агробактериальных плазмид от когдато возникшей про-Ti-плазмиды, изменение которой в ходе эволюции агробактерий привело к появлению ныне имеющегося разнообразия. В силу этого гомологичные области Ti- и Ri-плазмид считают консервативными, то есть наименее изменившимися в ходе такой дивергентной эволюции.

В соответствии с такой гипотезой наиболее консервативными должны были оставаться те участки плазмид, от которых зависит характерный только для агробактерий способ существования. И действительно, картирование мутаций, приводящих к потере способности агробактерий генетически колонизировать растения, показало, что все они попадают в области гомологии А и D.

Для получения локализованных на Ti-плазмидах мутаций использовали два подхода.

Один из них называется делеционное картирование и заключается в клонировании определенных фрагментов изучаемых Ti-плазмид на векторных плазмидах Е. coli с последующим получением укороченных вариантов клонированных последовательностей путем рестрикции и лигирования. После переноса плазмид с укороченной последовательностью в содержащие изучаемую Ti-плазмиду клетки агробактерий отбирали клоны, у которых исходный фрагмент заменялся на укороченный в результате гомологичной рекомбинации.

Второй подход базировался на использовании инсерционного мутагенеза, суть которого состоит в интеграции несущих гены антибиотикоустойчивости бактериальных транспозонов в ДНК Ti-плазмид. Такой способ получения мутаций позволяет определять локализацию мутированного инсерцией гена путем сравнения рестрикционных фрагментов исходной плазмиды и плазмиды с инсерцией.

Для введения транспозонов в ДНК Ti-плазмид использовали несколько методических приемов. Один из них заключался в получении инсерций транспозона в клонированный в клетках Е. coli фрагмент Ti-плазмиды и последующей рекомбинационной замены немутантного фрагмента на мутированный в клетках Agrobacterium tumefaciens.

В ряде случаев инсерции транспозона осуществляли непосредственно в Ti-плазмиды в клетках Е. coli. Для этого изучаемую Ti-плазмиду переносили методом конъюгации в штамм Е. coli, клетки которого имели транспозон, локализованный в хромосомной ДНК.

Передавать Ti-плазмиды в клетки Е. coli оказалось возможным при использовании плазмид широкого круга хозяев из групп несовместимости IncP и IncW. При введении таких плазмид в клетки Agrobacterium tumefaciens происходит образование коинтегратов, состоящих из введенной плазмиды и резидентной плазмиды Ti. Такой коинтеграт способен передаваться при конъюгации в клетки Е. coli и поддерживаться там за счет репликона плазмиды широкого круга хозяев. Во время пребывания коинтеграта в клетках Е. coli происходило перемещение транспозона из хромосомы в ДНК коинтеграта, и далее такой коинтеграт возвращали в клетки Agrobacterium tumefaciens.

Третий методический прием заключался в получении инсерций транпозонов в ДНК Ti-плазмид непосредственно в клетках Agrobacterium tumefaciens. Для этого в клетки агробактерий вводили неспособные реплицироваться в них плазмиды, содержащие транспозон, и культивировали эти клетки на средах с антибиотиком, устойчивость к которому определяется транспозоном. Проверка антибиотикорезистентных клонов агробактерий на наличие изучаемых свойств, позволяла отобрать мутанты с определенным фенотипом.

Применение транспозонового мутагенеза и делеционного картирования позволило точно установить, какие свойства агробактерий определяются плазмидными генами и определить относительное расположение этих генов в пределах плазмидной ДНК (Рис. 2).

Рис.2. Схема расположения групп генов на Ti-плазмиде нопалинового типа.

К 1988 году было установлено, что локализованные на Ti-плазмидах Agrobacterium

tumefaciens гены определяют:

1) способность агробактерий индуцировать образование опухоли на инфицированном растении;

2) состав опинов, вырабатываемых клетками опухоли;

3) способность агробактерий использовать опины в качестве источников углерода, азота и энергии;

4) чувствительность к агроцину К84 – бактериоцину нуклеотидной природы, продуцируемому штаммом К84 Agrobacterium rhizogenes (характерно только для плазмид нопалинового типа);

5) ограничение развития бактериофага Ар1;

6) конъюгативный перенос Ti-плазмид в клетки Agrobacterium и Rhizobium;

7) способность к автономной репликации и несовместимость с близкородственными плазмидами в клетках Agrobacterium и Rhizobium. Размеры плазмидных ДНК Ti- и Ri-плазмид могут колебаться в пределах 90 – 160 мегадальтон.

Первое из перечисленных в предыдущем абзаце свойств определяется генами, расположенными в консервативных областях А и D. Эти две области на картах Ti-плазмид расположены рядом и различаются как по размерам, так и функционально. Следует отметить, что анализ мутантов по признаку опухолеобразования осуществлялся путем инфицирования растений или модельных систем (ломтиков моркови, картофеля, проростков табака) и первоначально все варианты, неспособные вызвать опухоль, обозначались, как мутанты с фенотипом Onc-. Однако локализация первых мутаций, дающий такой фенотип, показала, что часть из них связаны с инсерциями или делециями в консервативной области А, а часть – с изменениями в консервативной области D. При этом выяснилось, что консервативная область А соответствует тем фрагментам, которые обнаруживаются в ДНК опухолевых клеток инфицированного растения, в то время как последовательности, соответствующие области D, в растительные клетки не переносятся.

Это позволило разделять неспособных вызывать опухоли мутантов на две группы:

название Onc--мутанты сохранили для вариантов с изменениями в пределах переносимой в растение Т-ДНК, а для мутантов с изменениями в консервативной области D было Vir--мутанты принято название (утратившие вирулентность). Соответственно консервативная область D Ti- и Ri-плазмид получила название область вирулентности.

Было также установлено, что локализованные в пределах Т-ДНК гены не транскрибируются в клетках агробактерий, а их активность проявляется только в клетках растений. В тоже время расположенные в консервативной области D гены определяют способность бактериальных клеток вступать в контакт с растительными клетками и обеспечивать передачу Т-ДНК из бактериальной клетки в растительную. Эти гены и кодируемые ими белки получили название vir-гены и Vir-белки соответственно.

Сравнение vir-генов Ti-плазмид нопалинового и октопинового типов показало, что большая часть из них являются практически одинаковыми, и собственно процесс переноса Т-ДНК в растительную клетку из штаммов с Ti-плазмидами обоих типов осуществляется сходным образом.

Обязательными для инфицирования растения являются продукты 21 vir-гена (табл.

1). Эти гены образуют несколько оперонов, регулируемых совместно и активирующихся при контакте с раневой поверхностью растения, что позволяет рассматривать совокупность таких генов как регулон.

–  –  –

Транскрипционная активность генов vir-регулона регулируется двухкомпонентной сенсорной системой, устроенной по общему для подобных бактериальных систем принципу. Собственно сенсорным белком в этой системе является кодируемый virА-геном белок VirА, представляющий собой трансмембранную гистидиновую киназу. Этот белок состоит из двух одинаковых субъединиц (рис. 3). Начиная от NH 2-конца, в каждой субъединице имеется небольшой цитоплазматический домен, затем короткий трансмембранный участок, периплазматический домен (на рис.3 обозначен Р), второй трансмембранный участок и далее три расположенных в цитоплазме домена: линкерный (связующий) домен (на рис. 3 обозначен L), киназный домен (на рис. 3 обозначен K) и ресиверный (укрывающий) домен (на рис. 3 обозначен R).

В пределах киназного домена в положении 474 имеется остаток гистидина (His474), который фосфорилируется при взаимодействии этого белка с молекулами АТФ.

Ресиверный домен в отсутствии индукторов закрывает эту часть киназного домена, но при их наличии она становится доступной для второго компонента сенсорной системы – белка VirG, и остаток фосфорной кислоты переносится на остаток аспарагиновой кислоты (Asp52) в этом белке. Фосфорилированный VirG-белок активирует транскрипцию пяти virоперонов – virB, virC, virD, virE, virH и трех отдельных vir-генов – virA, virG и virF. Для этого в промоторных областях всех этих генов и оперонов есть так называемые vir-боксы

– последовательности из 12 нуклеотидов, к которым присоединяется VirG-белок в димерном состоянии.

Индукторами фосфорилирования VirG являются фенольные соединения (ацетосирингон, -гидроксиацетосирингон и предшественники лигнина и суберина – конифериловый спирт, горчичный спирт, горчичная кислота, феруловая кислота), моносахариды (арабиноза, глюкоза, галактоза, манноза, фукоза, целобиоза, ксилоза, глюкуроновая кислота и галактуроновая кислота), низкие значения рН (от 5,0 до 5,8).

Максимальный уровень индукции наблюдается при сочетании всех трех факторов и реализуется при температурах не выше 32°С.

Доменом белка VirА, который связывается с фенолами, является не периплазматический, а внутриклеточный линкерный домен. Установлено также, что этот же домен важен для восприятия кислотных значений рН. В то же время моносахариды запускают работу vir-регулона, воздействуя на периплазматическую часть белка VirA.

Причем для того, чтобы воздействие сахаров было эффективным, необходим дополнительный белок с массой 31 кДа, который кодируется не плазмидным, а хромосомным геном chvE. Показано, что сначала моносахариды связываются с ChvEбелком, а затем комплекс моносахарид-ChvE присоединяется к белку VirA, в результате чего конформация белка меняется таким образом, что линкерный домен VirА-белка становится более пригодным для активации фенолами. Таким путем присутствие моносахаридов усиливает действие фенольных соединений как основных индукторов генов вирулентности.

Все эти сведения хорошо коррелируют с полученными еще в середине 20-го века данными, что инфицирование растения агробактериями наиболее успешно осуществляется при наличии в месте контакта раневого сока. Содержимое цитоплазмы и вакуолей поврежденных растительных клеток и вещества, необходимые для восстановления клеток или образования лигнифицированных или суберинизированных клеточных стенок, и являются основными индукторами для vir-генов, при этом рН раневого сока колеблется от 5,0 до 6,0.

Рис.3. Структура и схема функционирования двухкомпонентной сенсорной системы Agrobacterium tumefaciens. Пояснения см. в тексте.

(из Bacterial Signal Transduction: Network and Drug Targets, 2007) Существенно также и то, что для успешного инфицирования необходимо участие белков, кодируемых хромосомными генами агробактерий (табл. 2). Это объясняет, почему содержащие Ti-плазмиды бактерии Е. coli не способны трансформировать растительные клетки в опухолевые. В частности, показано, что активация транскрипции virG-гена зависит не только от самого VirG-белка. Экспрессия этого гена осуществляется с двух промоторов, расположенных друг за другом. Один из этих промоторов не имеет vir-бокса, и, по всей вероятности, определяет невысокий конститутивный уровень белка VirG, который повышается при фосфатном голодании. Это возможно потому, что данный промотор находится под контролем активатора транскрипции ChvI из двухкомпонентной сенсорной системы ChvG/ChvI, которая подобно системе PhoR/PhoB Е. coli регулирует метаболическую активность клеток агробактерий при фосфатном голодании. Кроме того продукт хромосомного гена ros является негативным регулятором транскрипции virC- и virD-оперонов, разнонаправленные промоторы которых находятся рядом в пределах virобласти Ti-плазмиды. Установлено также, что мутация в хромосомном гене miaA, кодирующем тРНК-изопентилрансферазу, примерно в 10 раз снижает уровень индукции всего vir-регулона.

Помимо хромосомных генов, которые влияют непосредственно на экспрессию virгенов Ti-плазмид, выявлено еще несколько генов хромосомной локализации, влияющих на вирулентные свойства агробактерий (табл. 2). Показано, что агробактериальные клетки способны хемотаксически перемещаться в почве к растению и далее непосредственно к поверхности растительных клеток, двигаясь по возрастающему градиенту концентраций выделяемых поврежденным растением моносахаридов. На этом этапе необходим уже упоминавшийся ранее углеводсвязывающий белок СhvЕ, кодируемый соответствующим хромосомным геном.

Таблица 2 Продукты хромосомных генов A.tumefaciens, участвующие в процессе инфицирования растения № Белок Выполняемая белком функция п/п tRNA isopentenyltransferase, влияет на индукцию vir-оперонов 1 MiaA Негативный регулятор virC- и virD-оперонов 2 Ros Транспорт компонентов 1,2-глюкана на поверхность клетки 3 ChvA Участие в синтезе компонентов 1,2-глюкана 4 ChvB Белок, связывающий моноуглеводы при хемотаксисе и индукции vir-оперонов 5 ChvE Сенсорный белок двухкомпонентной сенсорной системы, реагирующей на 6 ChvG фосфатное голодание Активатор транскрипции из двухкомпонентной сенсорной системы, 7 ChvJ реагирующей на фосфатное голодание ExoC Глюкозофосфатизомераза, влияет на синтез экзополисахаридов (PscA) Три белка наружной мембраны, участвуют в прикреплении A. tumefaciens к 9 Att поверхности растительной клетки Участие в транспорте Т-комплекса в растительную клетку 10 AchB Индукция синтеза целлюлозы в сайтах прикрепления 11 Cel Следующим обязательным этапом в инфицировании является прикрепление бактерий к поверхности растительной клетки, в котором определенную роль, вероятно, играют экзополисахариды. Это следует из того, что мутации в гене exoC (pscA), кодирующем глюкозофосфатизомеразу, снижают вирулентность. Таким же фенотипом обладают и мутанты по генам chvA и chvB. Установлено, что все эти три гена имеют отношение к синтезу (exoC и chvB) и транспорту на поверхность клетки (chvA) экзополисахарида 1,2-глюкана.

По всей вероятности и белковые компоненты наружной мембраны агробактерий необходимы для взаимодействия с растительной клеткой. Предположительно таковыми могут являться небольшой (14 кДа) Са2+-зависимый белок рикадгезин (его количество уменьшено у мутантов chvB) и три минорных белка наружной мембраны, отсутствующие у мутантов по генам att. Были также описаны мутанты со сниженной вирулентностью, при контакте которых с растительной клеткой не образуются целлюлозные фибриллы, удерживающие бактерии на ее поверхности (cel--мутанты). Продукт мутированного гена, вероятно, служит индуктором синтеза целлюлозы растительной клеткой. Еще один кодируемый хромосомным геном acvB белок функционирует не на этапе прикрепления бактерий к поверхности растительной клетки, а на этапе формирования структур, необходимых для переноса Т-ДНК в растительную клетку.

Считается, что экспрессия хромосомных генов агробактерий, необходимых для успешного инфицирования хозяина, контролируется двухкомпонентной сенсорной системой ChvG/ChvI.

Собственно перенос Т-ДНК в растительную клетку осуществляется продуктами плазмидных Для формирования канала, пронизывающего оболочку vir-генов.

бактериальной клетки, и так называемого Т-пилюса, продлевающего этот канал непосредственно до цитоплазмы растительной клетки, необходимы VirВ-белки. Схема сборки такого канала, в настоящее время называемого системой секреции типа IV (T4SS), изображена на рисунке 4.

Сначала с помощью белка VirВ8 белок VirВ1 выводится через цитоплазматическую мембрану в периплазматическое пространство и начинает перестройку пептидогликанового слоя в данном месте (позиция А на рис. 4). Затем белки VirВ4, VirВ10 и VirВ11 встраиваются во внутреннюю мембрану рядом с белком VirВ8, что способствует выходу в периплазму гетеродимера из белков VirВ7-VirВ9 и дальнейшему расщеплению пептидогликана. При этом от белка VirВ1 отщепляется фрагмент VirВ1*, который закрепляется в наружной мембране, определяя место формированияТ-пилюса.

Гетеродимеры VirВ7-VirВ9, благодаря наличию в белке VirВ7 липидного компонента, закрепляются в наружной мембране таким образом, чтобы белок VirВ9 был направлен в периплазматическое пространство (позиция В на рис. 4). Белки VirВ3 и VirВ5 также связываются с наружной мембраной в месте закрепления VirВ7 и создают условия для сборки циклических олигомеров из белка VirВ2 и формирования из них Т-пилюса. Во внутреннюю мембрану дополнительно встраиваются VirВ6 и VirD4, а новые молекулы VirВ9 связываются между собой и с молекулами VirВ11 так, чтобы образовался сплошной канал, соединяющий внутреннюю и наружную мембраны (позиция С на рис. 4).

Продолжением этого канала является полый Т-пилюс, пронзающий в конечном итоге цитоплазматическую мембрану растительной клетки. Тем самым формируется путь, соединяющий цитоплазмы двух клеток и позволяющий в один этап транслоцировать из бактериальной клетки в растительную субстраты системы секреции типа IV (T4SS) – белки и нуклеопротеины (позиция D на рис. 4).

Рис.4. Процесс построения системы секреции типа IV (T4SS). Пояснения см. в тексте.

Снабжать энергией процесс сборки системы секреции и, возможно, процесс собственно секреции потенциально могут белки VirВ4, VirВ11и VirD4, поскольку у них имеются АТФ-связывающие участки.

Параллельно со сборкой аппарата системы секреции в клетке осуществляется процессинг Т-ДНК, суть которого заключается в формировании так называемого Т-комплекса. Переносимый в растительную клетку фрагмент Ti-плазмиды, который называется Т-ДНК и соответствует консервативной области А, ограничен прямыми повторами, состоящими из 25 пар нуклеотидов. Непосредственно с Т-ДНК Ti-плазмиды взаимодействуют белки VirС1, VirD1 и VirD2. Основным в этой группе белков является VirD2, который представляет собой никирующую (разрезающую одну нить двунитевой молекулы ДНК) эндонуклеазу. Этот белок обладает сродством к концевым повторам Т-ДНК, но для его эффективного прикрепления к ним необходимы белки VirD1 и VirС1.

При этом VirD1 взаимодействует непосредственно с VirD2, определяя, как считается, его правильную ориентацию на двунитевой молекуле, тогда как белок VirС1 прикрепляется к двунитевой ДНК в непосредственной близости от концевых повторов. Было показано, что отсутствие белка VirС1 в клетках агробактерий приводит к снижению уровня вирулентности, но не к полной ее утрате, как это происходит у мутантов по гену virD1.

Поэтому сам белок получил название усилитель (enhancer) вирулентности, а место его прикрепления, которое представляет собой последовательность из 8 пар нуклеотидов, получило название усиливающая последовательность (overdrive sequence) или просто овердрайв.

Ключевым в образовании Т-комплекса считается правый концевой повтор Т-ДНК.

Именно здесь эндонуклеаза VirD2 делает надрез одной нити ДНК, и начинается отсоединение этой нити от комплементарной ей в направлении левого концевого повтора, при этом сама эндонуклеаза остается прикрепленной к 5-концу отделяющейся нити.

Одновременно происходит заполнение образующейся в Т-ДНК бреши новыми нуклеотидами, так что при полном отделении старой нити (для этого вторая молекула VirD2, прикрепленная к левому концевому повтору, делает однонитевой надрез и в нем) Т-ДНК остается такой же, как и была. Отделившаяся нить с VirD2-белком на 5-конце и представляет собой Т-комплекс, который направляется к тому участку внутренней мембраны клетки, где находится начало секреторного канала системы секреции типа IV.

При участии белка VirD4 Т-комплекс поступает в канал системы секреции типа IV и транспортируется в цитоплазму растительной клетки. Кроме Т-комплексов в растительную клетку с помощью этой же системы переносятся белки VirЕ2, VirЕ3 и VirF.

В С-концевых областях всех этих белков имеются аминокислотные последовательности, от которых зависит их транспорт системой секреции типа IV. Подобная последовательность обнаружена и в белке VirD5, хотя прямых доказательств его присутствия в трансформированных агробактериями растительных клетках не имеется.

Белок VirЕ3 считается шапероном (вспомогательным белком) для транспорта белка VirЕ2 в растительную клетку и предполагается, что он уже внутри растительной клетки может влиять на процесс экспрессии растительных генов, поскольку показано его способность проникать в ядро и связываться с одним из общих транскрипционных факторов растительных клеток pBrp (plant-specific TFIIB-related protein) (рис. 5). Наиболее важная функция внутри растительной клетки установлена для белка VirЕ2. Его молекулы присоединяются к Т-комплексу по всей его длине, защищая однонитевую ДНК от расщепления растительными эндонуклеазами, и совместно с белком VirD2 определяют транспорт Т-комплекса в ядро. Последняя функция определяется наличием в аминокислотных последовательностях VirD2 и VirЕ2 специальных сигналов ядерной локализации (nuclear localisation signal – NLS) и способностью VirЕ2 связываться с двумя растительными белками, которые получили соответствующие названия VirE2-interacting proteins, сокращенно VIP1 и VIP2. Эти белки обеспечивают контакты Т-комплекса с аппаратом ядерных пор путем взаимодействия с растительным белком импортином, что и определяет перемещение Т-комплекса из цитоплазмы в нуклеоплазму.

Рис. 5. Активность агробактериальных Vir-белков в растительной клетке.

Предполагается, что и VirD2 и VirЕ2 участвуют далее в процессе интеграции Т-ДНК в хромосомную ДНК растения, но только после того, как еще один перешедший из клеток агробактерий белок VirF обеспечит расщепление растительного белка VIP1 в протеосомах ядра и освобождение от него Т-комплекса.

Из остальных Vir-белков функционально охарактеризованы VirН1 и VirН2. Оба они являются монооксигеназами из семейства цитохром Р450-зависимых оксигеназ, причем для VirН2 показана способность О-деметилировать поступающую в бактериальную клетку феруловую кислоту, превращая ее в кофейную кислоту. Исходя из того, что феруловая кислота является активатором vir-генов, а кофейная – нет, предполагается, что VirН-белки регулируют индукцию vir-регулона. VirJ-белок функционально заменяет продукт хромосомального гена acvB. Функции продуктов virK-, virL-, virM-, virP- и virRгенов пока не охарактеризованы.

Изучение структуры фрагментов Ti-плазмид, соответствующих консервативной области А, показало общий принцип их организации. Во всех плазмидах это типичная Т-ДНК с концевыми прямыми повторами длиной 25 пар нуклеотидов, между которыми располагаются гены, не способные транскрибироваться в прокариотической клетке.

Отличительной чертой Т-ДНК октопиновых плазмид является наличие внутри Т-ДНК еще двух таких же повторов, что приводит к разделению Т-ДНК на ТL-ДНК (левая Т-ДНК) и ТR-ДНК (правая Т-ДНК) длиной 13 т.п.н. и 7,8 т.п.н. соответственно (рис. 6). Повторы в этом случае обозначены буквами латинского алфавита, начиная с левого: повтор А – это левая граница ТL-ДНК, повтор В – это правая граница ТL-ДНК, повтор С – это левая граница ТR-ДНК и повтор D – это правая граница ТR-ДНК. Благодаря этому Т-ДНК октопиновых плазмид в растительную клетку может переноситься и интегрироваться в растительный геном и как единая последовательность (при начале формирования Т-комплекса с концевого повтора D), и как два отдельных фрагмента (при начале формирования Т-комплекса с повторов В и D). Т-ДНК Ti-плазмид других типов и Ri-плазмид всегда переносится как единый Т-комплекс.

Рис. 6. Генетическая карта Т-ДНК плазмид октопинового типа. 0 соответствует первому нуклеотиду левого концевого повтора (Border A). Гены, транскрибируемые слева направо, показаны зеленой полосой над картой, транскрибируемые слева направо – зеленой полосой под картой. (Из обзора Jun Zhu et al. J.Bacteriol., 2000) Суммарно в Т-ДНК октопиновых плазмид располагается 13 генов, в нетранслируемых областях которых имеются типичные эукариотические ТАТА- и СААТбоксы и полиА-сайты. Из этого следует, что продукты этих генов синтезируются только в растительной клетке и от них зависят отличия опухолевых клеток от обычных.

Как правило, в левой части Т-ДНК Ti-плазмид находятся гены, определяющие способность опухолевых клеток к интенсивному делению. В плазмидах октопинового типа это два гена iaaM и iaaH, продукты которых катализируют превращение триптофана сначала в индолацетамид, а затем в индолилуксусную кислоту (растительный гормон роста ауксин). Кодируемый геном белок соединяет изопентинилфосфат и ipt аденозинмонофосфат (АМФ) и далее изопентиладенозинмонофосфат под воздействием растительных ферментов превращается в цитокинин зеатин. Вспомогательную роль в опухолеобразовании играют ген 5 и ген 6b. Продукт первого из них определяет образование индол-3-лактата, который является антагонистом ауксина и регулирует скорость деления опухолевых клеток. Продукт гена 6b (его также называют ген tml) повышает чувствительность растительных клеток к гормонам роста.

Ближе к правому концу левой части Т-ДНК октопиновых плазмид расположены два гена, определяющие способность опухолевых клеток синтезировать опины. Ген ocs кодирует октопинсинтазу, которая катализирует реакции конденсации пирувата с аргинином, лизином, гистидином или орнитином, что соответственно приводит к продукции октопина, лизопина, гистопина и октопиновой кислоты. Рядом с этим геном располагается ген ons, продукт которого обеспечивает выделение синтезируемых опинов из опухолевых клеток в межклеточное пространство. Остальные гены синтеза опинов – mas1, mas2 и ags – расположены в правой Т-ДНК октопиновых плазмид. Кодируемый геном mas2 фермент катализирует реакции конденсации глютамина или глютаминовой кислоты с глюкозой, а затем продукт гена mas1 доводит полученные соединения до маннопина и маннопиновой кислоты соответственно. Ген ags кодирует фермент, превращающий маннопин в агропин. И маннопин, и агропин могут самопроизвольно превращаться в агропиновую кислоту, таким образом в опухолях, вызванных агробактериями с плазмидами октопинового типа можно обнаруживать восемь опинов – четыре из октопинового семейства и четыре из агропинового (маннитилового) семейства.

Принципиально функциональный состав Т-ДНК Ti-плазмид всех типов сходен: в них всегда имеются две группы генов – гены опухолеобразования и гены синтеза опинов.

И если по первой группе генов существенных различий не обнаруживается, то на основании различий по генам второй группы плазмиды и разделяют на типы. При этом между плазмидами основных типов (нопалинового, октопинового и агропинового) имеются и различия по генам утилизации опинов, которые не входят в консервативную область А, а располагаются в консервативной области В. Причем всегда имеет место соответствие между генами, определяющими продукцию конкретных опинов опухолевыми растительными клетками, и генами утилизации именно этих опинов на соответствующей Ti-плазмиде.

Принцип функциональной организации этого фрагмента Ti-плазмид можно также рассмотреть на примере плазмид октопинового типа. Для использования опинов в качестве питательных веществ необходимо около 40 генов. Функционально их можно разделить на несколько групп. Одна из этих групп обеспечивает распознавание опинов в окружающей среде, и продукты таких генов действуют совместно с системой хемотаксиса агробактериальной клетки. Еще одну группы составляют гены АВС-пермеаз, обеспечивающих энергозависимое поглощение соответствующих опинов агробактериальной клеткой. В частности, в плазмидах октопинового типа хорошо охарактеризованы гены, кодирующие имеющие АТФ-связывающую кассету (АВС) пермеазы октопина, агропина, маннопина, агропиновой и маннопиновой кислот.

Третья группа генов – это гены катаболизма соответствующих опинов. Суть катаболизма этих соединений заключается в превращении их в обычные сахара и аминокислоты, для чего необходимы специализированные ферменты. Например, продукт гена agaE переводит агропиновую кислоту в маннопиновую кислоту, а затем продукты генов agaF и agaG расщепляют последнюю до маннозы и глютаминовой кислоты. Сходным образом продукты генов mocC и mocD превращают маннопин в глютамин и глюкозу. Далее такие обычные соединения используются клеткой в общих метаболических путях.

Еще одним обязательным фрагментом всех Ti-плазмид является участок, который обеспечивает репликацию плазмиды и распределение ее копий между дочерними клетками. На схемах этот фрагмент может быть обозначен как точка ori или oriV (от англ.

origin – начало репликации). Как правило, он располагается в консервативной области В, но может находиться и в консервативной области С, где также находятся гены traоперона. Гены этого оперона кодируют белки, определяющие способность агробактериальной клетки передавать копии плазмидной ДНК другим бактериальным клеткам при конъюгации. Установлено, что процесс конъюгационной передачи плазмид регулируется выделяемыми растительными клетками опинами, а также синтезируемыми собственно бактериальными клетками веществами из семейства гомосеринлактонов, то есть системой определения плотности бактериальной популяции (quorum sensing system).

То, что Ti-плазмиды являются конъюгативными (трансмиссибельными) плазмидами и их перенос регулируется подобным способом, имеет существенное приспособительное значение. Осуществляемая агробактериями генетическая колонизация приводит к быстрому размножению использующих опины бактерий внутри растущей на растении опухоли. При интенсивном делении клеток репликация плазмид может, условно говоря, не успевать за скоростью деления, в результате чего часть из них оказывается бесплазмидными. А поскольку на плазмидах находятся гены утилизации опинов, эти клетки теряют свое основное селективное преимущество в данной экологической нише.

Однако благодаря включающемуся конъюгативному переносу эти клетки восполняют потерю, что и способствует выживанию популяции.

Все выше рассмотренные области являются обязательными для Ti-плазмид выделяемых из природных источников штаммов агробактерий. Из других наиболее часто упоминаемых фрагментов в описаниях охарактеризованных Ti-плазмид различных типов можно отметить участок ape (от англ. bacteriophage Ap1 exlusion), от наличия которого зависит устойчивость бактериальных клеток к бактериофагу Ар1, и для нопалиновых плазмид – локус agr, от которого зависит чувствительность к агроцину (нуклеотидному бактериоцину, выделяемому штаммом Agrobacterium rhizogenes K84).

Подводя итог описанию природных Ti-плазмид и процесса естественной трансформации растительных клеток агробактериями, следует еще раз подчеркнуть две важных особенности. Первое это то, что для процесса переноса Т-ДНК в растительную клетку и встраивания ее в геном растения не имеет значения, какие гены находятся между концевыми повторами. Если эти повторы и прилегающие к ним области overdrive остаются неизменными, все, что находится между ними, будет интегрировано в хромосомы растения. И второе: для успешной трансформации растительных клеток необходимы продукты генов vir-регулона. Опираясь на эти свойства, и удалось в короткое время разработать эффективную систему направленной трансформации растений с помощью векторных молекул на основе Ti-плазмид.

Агробактериальные векторные системы для получения трансгенных растений Вектор в биологическом смысле – это молекула нуклеиновой кислоты, обеспечивающая введение наследственной (генетической) информации в клетки и создание условий для ее выражения (реализации) и поддержания в ряду поколений того или иного вида организмов. В зависимости от того, в клетки каких организмов необходимо ввести генетическую информацию, векторы могут существенно различаться, но вне зависимости от этого они должны соответствовать еще нескольким общим требованиям, определяемым методами работы с нуклеиновыми кислотами. Исходя из этого, представляется интересным обсудить природные Ti-плазмиды с точки зрения их пригодности для использования в генно-инженерных работах.

Трем первых общим требованиям, изложенным в собственно формулировке понятия биологический вектор, Ti-плазмиды соответствуют вне всякого сомнения. Собственно процесс трансформации (превращения) обычных растительных клеток в опухолевые заключается в переносе Т-ДНК в растительную клетку, который осуществляется в результате деятельности специализированных белков, кодируемых имеющимися на плазмиде генами. Тем самым реализуется первое требование – введение. Введенная в растительную клетку Т-ДНК доставляется в ядро и встраивается в хромосомы растительных клеток. Трансформированные клетки растений вырабатывают гормоны роста и опины, что свидетельствует о таком встраивании в хромосомы, которое обеспечивает второе требование – создание условий для реализации введенной генетической информации. Возникающие в результате деления таких клеток дочерние клетки продолжают выделять цитокинины и опины, а, значит, обеспечивается и третье требование – стабильное поддержание введенной генетической информации в рядах поколений делящихся клеток. Более того, специальные эксперименты, проведенные в конце 1970-х – начале 1980 годов, показали, что в регенерированных из опухолевых клеток растениях табака соответствующие Т-ДНК фрагменты обнаруживаются методом блоттинг-гибридизации в клетках всех органов. При этом реализуется и кодируемая этими фрагментами генетическая информация – характерный только для опухолевых клеток фермент лизопиндегидрогеназа присутствовал во всех клетках регенерированных растений. Такими же свойствами обладали и все потомки, полученные при вегетативном размножении этих регенерантов. Опыление таких растений пыльцой нормальных растений табака давало потомство, 50% которого содержало Т-ДНК и синтезировало лизопиндегидрогеназу. При опылении нормальных растений табака пыльцой регенерантов из опухолевых клеток также наблюдалось близкое к 50% значение – 43% потомков было положительным при анализе по этим же признакам. Среди потомков, полученных при самоопылении гибридных растений, 71% имело Т-ДНК и лизопиндегидрогеназу в клетках. Из этого следует, что признак, определяемый введенным в составе Т-ДНК геном, наследуется в рядах поколений (передается вертикально) при семенном (т.е. половом) размножении растений согласно менделевским закономерностям.

Таким образом, стабильное наследование введенной с помощью Ti-плазмид информации подтвердилось не только на уровне поколений клеток, но и на уровне поколений целостных организмов.

Плюс к этому описанные эксперименты сняли вопрос и еще об одном требовании к векторам для работы с растениями. Это требование гласит: вектор не должен препятствовать регенерации растения из отдельных растительных клеток и его размножению вегетативным и семенным путем.

Одним из важных с точки зрения генетической инженерии требованием к биологическим векторам является их емкость. Под этим термином понимают то количество генетической информации, которое может нести вектор без нарушения его основных свойств – способности эффективного введения и стабильного наследования. С этой точки зрения Ti-плазмиды также являются вполне пригодными – размер природных Т-ДНК (более 20 т.п.н.) и количество расположенных в них генов (около 15). Более того, в ряде экспериментов было показано, что увеличение размеров Т-ДНК до 50 т.п.н. не сказывается на эффективности ее введения в растительные клетки и не препятствует ее интеграции в хромосомы.

При выборе векторов для генно-инженерных манипуляций с конкретной группой организмов всегда учитывают его, так называемую, хозяйскую специфичность.

Применительно к векторным системам для работы с растениями желательно, чтобы с их помощью можно было вводить генетическую информацию в любые растения, используемые человеком. И в этом плане агробактерии оказываются лучше многих других векторных систем – естественным образом они способны инфицировать все виды покрытосеменных растений из класса Двудольные, а в лабораторных условиях удалось применить их для трансформации растений разных видов из класса Однодольные, а также из отдела Голосеменные.

Но вот еще одному требованию – вектор не должен вызывать патологического состояния в трансформированном организме – природные Ti-плазмиды не соответствуют.

Кроме того, их размеры (от 90 до 160 мегадальтон или около 200 т.п.н.) мало пригодны для эффективных манипуляций с их ДНК на стадии введения фрагментов с необходимой генетической информацией. Отсутствуют в составе Т-ДНК и хорошие селективные и репортерные маркеры - гены, по активности которых можно было бы легко отбирать трансформированные клетки и подтверждать наличие введенного фрагмента ДНК в геноме трансформированного организма. Сайты для наиболее используемых в генетической инженерии рестрикционных ферментов в Т-ДНК имеются, но их количество и расположение не является оптимальным для осуществления направленных инсерций.

Однако все перечисленные выше недостатки Ti-плазмид удалось поэтапно преодолеть еще на стадии их изучения. Обработка ДНК Ti-плазмид рестриктазами и последующее клонирование полученных фрагментов на векторных молекулах в системе Е. coli позволило избежать трудностей, связанных с большими размерами исходных плазмид. Получение содержащих Т-ДНК вариантов стандартных векторных молекул на основе плазмид серии pBR позволило осуществлять всю работу по встраиванию предназначенных для введения в растительные клетки фрагментов ДНК с использованием хорошо отработанных методик и штаммов Е. coli.

Достаточно быстро выяснилось, что удаление из Т-ДНК генов синтеза ростовых гормонов снимает патологический эффект и в тоже время не сказывается на эффективности переноса и интеграции Т-ДНК в геном растений. Более того, возможна полная замена всех генов между концевыми повторами Т-ДНК на практически любые последовательности. Главное, чтобы концевые повторы и прилегающие к ним несколько десятков нуклеотидов оставались не измененными. Это позволило создать плазмиды с расположенными должным образом полилинкерами (небольшими участками ДНК, содержащими уникальные для этих плазмид сайты рестрикции для нескольких различных рестриктаз) и маркерными генами для отбора трансформированных растительных клеток.

В отношении выбора маркерного гена удачным оказалось то, что растительные клетки являются чувствительными к одному из широко применяемых антибиотиков – канамицину. Известно, что у бактерий имеются специфические гены, обуславливающие устойчивость к аминогликозидным антибиотикам неомицину и канамицину. Такие гены кодируют белок неомицинфосфотрансферазу, который инактивирует эти антибиотики, перенося на их молекулы фосфатную группу. Однако промоторы бактериальных генов неомицинфосфотрансфераз не распознаются эукариотической системой транскрипции, то есть такие гены оказываются не функциональными в растительных клетках. Поэтому необходимо было провести объединение структурной области гена неомицинфосфотрансферазы с промоторными и терминаторными областями какого-либо гена, экспрессирующегося в эукариотических клетках. Одним из таких генов оказался ген нопалинсинтазы из Т-ДНК Ti-плазмид нопалинового типа. Сочетание его промоторной области, гена неомицинфосфотрансферазы из бактериального транспозона Тn5 и сайтов полиаденилирования и терминации транскрипции из гена нопалинсинтазы оказалось конститутивно работающим в растительных клетках гибридным геном. Эта генетическая конструкция, коротко обозначаемая в описании векторов как P NOS -NPT- tNOSPoly(A), быстро доказала свою эффективность при ее использовании в трансформации растений различных видов.

Еще несколько подобных генетических конструкций также получили широкое распространение. В одной из них – P35S RNA CaMV -NPT- tNOSPoly(A) – использован также конститутивно работающий промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. Имеется еще несколько конструкций, в которых использованы структурные гены, придающие растительным клеткам устойчивость к другим антибиотикам. Устойчивость к гигромицину В дают конструкции с геном гигромицинфосфотрансферазы: P NOS -HPTtNOSPoly(A), P35S RNA CaMV -HPT- tNOSPoly(A) и P19S RNA CaMV -HPT- tNOSPoly(A), устойчивость к блеомицину – P35S -BLE- tNOSPoly(A), устойчивость к триметоприму и RNA CaMV метотрексату – с геном дигидрофолатредуктазы: PNOS -DHFR- tNOSPoly(A).

В настоящее время для создания трансгенных растений сельскохозяйственного применения в качестве маркерных и селективных генов используют гены устойчивости к тем или иным гербицидам. В этом случае селективный ген является и целевым геном, придающим растению хозяйственно-полезный признак.

Полилинкеры в таких мультикопийных плазмидах, как правило, располагают непосредственно за промотором, с которого должна обеспечиваться транскрипция в растительной клетке. Если необходим высокий уровень конститутивной экспрессии вводимого в растение гена, широко используются уже упомянутые выше промоторы P35S и PNOS. В этом случае для получения функционального гена достаточно RNA CaMV осуществить вставку структурной последовательности по одному из сайтов полилинкера.

Для введения генов, содержащих свой промотор, используются такие варианты плазмид, в которых имеется только полилинкер и один из маркерных (селективных) генов.

Таким образом, процесс создания пригодных для введения в геном растения генетических конструкций осуществляется в системе Е. coli, но для передачи такой «нагруженной» Т-ДНК в растительные клетки необходимо использовать клетки Agrobacterium tumefaciens, содержащие Ti-плазмиду. Поэтому следующим этапом является введение векторной плазмиды в клетки агробактерий. Это можно осуществлять либо путем трансформации, либо путем конъюгации.

Наиболее часто применяют последний вариант, поскольку он гораздо легче осуществим в методическом плане. Поэтому в большинстве вариантов векторных плазмид, предназначенных для введения генов в растения, имеются особые участки, обеспечивающие передачу их в реципиентные клетки при конъюгации. Обычно это так называемый mob-сайт (от англ. mobilization) из плазмид группы несовместимости IncP.

Эти плазмиды являются плазмидами широкого круга хозяев, то есть способны хорошо переноситься в клетки различных видов бактерий, в том числе и в клетки агробактерий.

Важно, что такие плазмиды обеспечивают перенос неспособных самостоятельно передаваться при конъюгации (нетрансмиссибельных) плазмид, если в них имеется сайт мобилизации. При совмещении в одной клетке плазмиды широкого круга хозяев (мобилизующей плазмиды) и векторной плазмиды с mob-сайтом (мобилизуемой плазмиды) происходит передача последней в реципиентную клетку. Поэтому для доставки «нагруженной» векторной плазмиды в агробактерии достаточно смешать клетки Е. coli с двумя плазмидами с клетками Agrobacterium tumefaciens, содержащими Ti-плазмиду, выдержать эту смесь в надлежащих условиях положенное для осуществления конъюгации время, и провести высев на селективную среду, обеспечивающую отбор агробактерий с векторной плазмидой.

Проведенные в начале 1980-х годов эксперименты показали, что передача Т-ДНК из агробактерий в растительную клетку происходит вне зависимости от того, находится ли Т-ДНК и vir-гены в одной плазмиде (cis-положение) или же в разных (trans-положение).

Поэтому существует два типа векторных систем для агробактериальной трансформации растительных клеток (рис. 7).

Рис. 7. Основные типы векторных систем для агробактериальной трансформации растений (буквами Л и П обозначены левый и правый концевые повторы Т-ДНК соответственно).

Одна из этих систем называется бинарной, так как в клетках агробактерий присутствуют две независимо реплицирующиеся плазмиды: векторная плазмида с «нагруженной» Т-ДНК и Ti-плазмида с vir-генами. В этом случае векторная плазмида обязательно содержит участок, который обеспечивает ей стабильное наследование в клетках агробактерий (на рис. 5 этот участок обозначен как Agrobacterium tumefaciens ori).

Чаще всего это фрагмент из плазмид широкого круга хозяев IncP-группы несовместимости, содержащий точку начала вегетативной репликации и гены rep-области.

В такой системе в качестве второй плазмиды потенциально может быть использована любая Ti-плазмида с полноценным vir-регулоном. Однако, во избежание переноса собственной Т-ДНК такой плазмиды, лучше использовать делеционные варианты, в которых полностью отсутствует консервативная область А или хотя бы содержащая правый концевой повтор часть Т-ДНК. Как правило, такая «обезоруженная»

Ti-плазмида должна быть специально помечена геном антибиотикорезистентности, что позволяет контролировать ее присутствие в клетках агробактерий в процессе их использования.

Коинтегративная векторная система получила свое название не зря.

Используемые в ней плазмиды должны после совмещения их в клетках агробактерий объединяться в коинтеграт, переводя «нагруженную» Т-ДНК и vir-регулон в cisположение. Такое объединение возможно при наличии в обоих плазмидах гомологичных участков, обеспечивающих рекомбинацию путем кроссинговера.

Предназначенные для использования в этой системе многокопийные векторные плазмиды, в которые осуществляется вставка интересующего исследователя (целевого) гена, должны быть устроены не так, как плазмиды для бинарной системы. В их составе, как правило, имеется фрагмент, содержащий только правую часть Т-ДНК с правым концевым повтором (а не оба концевых повтора, как в векторе для бинарной системы) и достаточно протяженный участок, гомологичный левой части Т-ДНК используемой в этой системе Ti-плазмиды. Кроме этого, в такой плазмиде отсутствует участок, обеспечивающий репликацию и стабильное наследование в клетках агробактерий, что обеспечивает после совмещения двух плазмид отбор только тех клеток, в которых произошла рекомбинация (коинтеграция).

В свою очередь используемые в этой системе Ti-плазмиды должны не содержать правого концевого повтора Т-ДНК, но обязательно содержать левый концевой повтор и прилегающий к нему участок, гомологичный тому фрагменту, который находится в векторной плазмиде. Это необходимо для того, чтобы в результате гомологичной рекомбинации в коинтеграте сформировалась Т-ДНК с обоими концевыми повторами, между которыми и окажется предназначенная для введения в растительную клетку генетическая конструкция.

Ярким примером такой векторной системы является созданная в 1980-х годах SEVсистема (от англ. split end vector – вектор разорванных концов), включающая векторы для вставки целевого гена серии pMON и вспомогательную плазмиду pTiB6S3–SE. Один из таких векторов pMON200 сконструирован их хорошо охарактеризованных фрагментов

ДНК:

1) участок последовательности плазмиды рBR322 размером 1,6 т.п.н., содержащий гены, ответственные за репликацию в клетках Е. coli и mob-сайт для конъюгативного переноса в клетки Agrobacterium tumefaciens за счет мобилизации плазмидой широкого круга хозяев Inc P-группы;

2) фрагмент плазмиды pTiT37 размером 2,2 т.п.н., который несет правую границу нопалиновой Т-ДНК и ген нопалинсинтазы;

3) гены устойчивости к стрептомицину и спектиномицину из бактериального транспозона Tn7, размер фрагмента – 2,7 т.п.н.;

4) последовательность размером 1,6 т.п.н., несущая селективный ген для отбора трансформированных растительных клеток PNOS -NPT- tNOSPoly(A);

5) синтетический полилинкер с сайтами рестрикции для рестриктаз HindIII, XhoI, BglII, XbaI, EcoRV, ClaI, EcoRI; 6) фрагмент Т-ДНК из октопиновой плазмиды pTiA6 размером 1,6 т.п.н., называемый LIH (от англ. left inside homology – левый внутренний участок гомологии) и обеспечивающий возможность образования коинтеграта со вспомогательной Ti-плазмидой. Суммарный размер плазмиды pMON200 – 9, 5 т.п.н.

Ti-плазмида pTiB6S3-SE, используемая в этой системе в паре с pMON200, получена путем замены всей правой Т-ДНК и около 80% левой Т-ДНК октопиновой плазмиды pTiB6S3 на ген устойчивости к канамицину из бактериального транспозона Tn903. При этом 20% левой Т-ДНК и левый концевой повтор сохранены в интактном состоянии. В пределах этого участка Т-ДНК имеется последовательность, гомологичная LIH-фрагменту из плазмиды pMON200, что обеспечивает кроссинговер, приводящий к встраиванию pMON200 в большую по размерам плазмиду pTiB6S3-SE. Тем самым в таком коинтеграте «разорванные концы» собираются в Т-ДНК, пригодную для переноса в растительную клетку. При этом внутри такой Т-ДНК оказываются те генетические конструкции, которые предназначены для введения в геном растения.

Для получения нужных коинтегратов используется так называемое трехродительское скрещивание. Бактерии Е. coli, содержащие R-плазмиду широкого круга хозяев IncP-группы несовместимости (первый донор), смешивают с бактериями Е. coli, в клетках которых находится «нагруженная» плазмида pMON200 (первый реципиент).

Через полчаса в эту смесь добавляют устойчивую к хлорамфениколу культуру Agrobacterium tumefaciens, в клетках которой присутствует плазмида pTiB6S3–SE (второй реципиент). В течение часа первый реципиент, ставший после восприятия плазмиды IncPгруппы донором (второй донор), передает второму реципиенту мобилизуемую плазмиду pMON200. Затем всю эту смесь высевают на агаризованную среду, содержащую три антибиотика – канамицин, стрептомицин и хлорамфеникол. На такой селективной среде колонии образуют только те клетки агробактерий, которые восприняли при конъюгации плазмиду pMON200 (на ней находится ген устойчивости к стрептомицину) и в которых произошло образование коинтеграта с несущей ген устойчивости к канамицину плазмидой pTiB6S3-SE (сама плазмида pMON200 в клетках агробактерий поддерживаться не может). Контрселекция (предупреждение образования колоний донорскими штаммами Е. coli) осуществляется хлорамфениколом. Полученные таким образом агробактерии пересевают на такую же среду и используют в дальнейшем для получения трансгенных растений.

Еще одним вариантом коинтегративной векторной системы являются плазмиды серии pGV. Исходно плазмида pGV представляет собой укороченный вариант рBR325, в котором остался только ген стрептомицинрезистентности, и ее размеры составляют 8,9 т.п.н.. На ее основе была сконструирована плазмида pGV831, в которой между левым и правым концевыми повторами Т-ДНК расположен BamHI-сайт для клонирования целевых генов и уже известная вам конструкция для отбора трансформированных растительных клеток PNOS -NPT- tNOSPoly(A). В пару ей была получена плазмида pGV2260, для чего в уже упоминавшейся плазмиде pTiB6S3 заменили всю Т-ДНК на фрагмент плазмиды рBR322. При совмещении плазмид pGV831 и pGV2260 в клетках A. tumefaciens в результате одного акта кроссинговера между имеющимися в этих плазмидах последовательностями рBR с высокой частотой формируется рекомбинантная плазмида, несущая «нагруженную» Т-ДНК и необходимые для ее переноса в растительные клетки vir-гены.

В рассмотренных примерах рекомбинационные события, приводящие к образованию коинтегратов, осуществляются в клетках Agrobacterium tumefaciens, но коинтеграты можно получать и в клетках Е. coli, где гомологичная рекомбинация может происходить более эффективно, чем в клетках агробактерий. Для этого реципиентную Ti-плазмиду с помощью плазмиды широкого круга хозяев передают в клетки Е. coli, в которых находится «нагруженная» целевым геном многокопийная плазмида небольшого размера, а затем проводят обратное скрещивание таких Е. coli с агробактериями, проводя отбор по маркеру «нагруженной» плазмиды.

К середине 90-х годов 20-го столетия стало понятно, что обе системы агробактериальных векторов – и коинтегративная, и бинарная - обладают приблизительно одинаковой эффективностью и являются основными в экспериментах по получению трансгенных растений как для научных целей, так и для практического использования.

Получение трансгенных растений методом агроинфекции Для непосредственного введения в растительный геном необходимой генетической информации с помощью несущих «нагруженные» Т-ДНК агробактерий используется несколько подходов. Один из них – это воздействие агробактерий на целостное растение, проростки семян, или ткани изолированных органов. Естественно, что при таком подходе только часть клеток растения получает вводимую генетическую информацию, поэтому для получения полностью трансгенного растения из обработанного бактериями органа с помощью культивирования на средах, содержащих селективный для трансформированных растительных клеток агент (например, антибиотик канамицин), получают каллусы и далее регенерируют из них растение.

Наиболее часто применяемый в настоящее время прием – это подготовка изолированных листьев или побегов путем обмывания их поверхности моющими и стерилизующими растворами, разделения в асептических условиях на фрагменты (экспланты) и нанесения на поверхность фрагментов культуры агробактерий посредством их погружения в суспензию бактериальных клеток на несколько минут. Затем фрагменты растения помещают на агаризованную среду, индуцирующую образование каллусов, которая содержит селективный для трансформированных растительных клеток агент (например, канамицин в концентрации 50 мкг/мл), и культивируют несколько дней на свету при комнатной температуре. Этот этап называют кокультивацией (совместным культивированием) эксплантов и агробактерий. Наличие у эксплантов раневых поверхностей обеспечивает эффективный контакт агробактерий и клеток растения, в ходе которого и происходит введение Т-ДНК.

Следующим этапом является удаление агробактерий с поверхности эксплантов, для чего экспланты переносят в стерильную воду, встряхивают для отмывания и затем подсушивают на поверхности стерильной фильтровальной бумаги. Далее экспланты переносят в жидкую каллусиндуцирующую среду с канамицином и антибиотиком, к которому чувствительны агробактерии (например, ампициллином), и культивируют при температуре 25 С и фотопериоде 16/8 часов в течение нескольких дней при постоянном перемешивании.

После отмывания экспланты переносят на агаризованную каллусиндуцирующую среду с обоими антибиотиками (канамицин + ампициллин) и продолжают культивирование до формирования хорошо выраженных каллусов, Затем из каллусов получают регенеранты, дающие начало линии трансформированных растений.

В случае неэффективности описанного выше метода возможна кокультивация агробактерий и суспензионной культуры клеток растений или их протопластов.

В последнем варианте предварительно полученные протопласты помещают в условия, способствующие восстановлению клеточных стенок, выдерживают некоторое время до начала построения элементов клеточной стенки и затем вносят бактериальные клетки в соотношении приблизительно 400 бактерий на один протопласт. Добавление бактерий именно в этот период способствует формированию эффективных контактов между агробактериальной и растительной клеткой, так как оседающие на поверхность таких «полупротопластов» бактерии закрепляются образующимися при регенерации клеточной стенки целлюлозными волокнами. Кокультивацию продолжают до полной регенерации клеточных стенок, после чего проводят высев на агаризованную среду для культивирования растительных клеток, содержащую селективный агент для трансформированных клеток растений и антибиотик, убивающий бактериальные клетки.

Из образовавшихся в таких условиях каллусов регенерируют растения-трансформанты.

В настоящее время, благодаря усовершенствованию методик, удалось преодолеть характерную для природных штаммов агробактерий неспособность инфицировать растения из класса Однодольные и успешно трансформировать с их помощью высшие растения практически любого вида. Это сделало агробактериальную систему получения трансгенных растений основной в работе по получению трансгенных растений. Тем не менее, продолжаются исследования возможности применения других векторных систем для введения генетической информации в растительные геномы.

Использование вирусов для генетической трансформации растений Среди 28 групп поражающих растения вирусов наиболее пригодными для целей генетической инженерии растений первоначально считали вирусы из семейства Caulimoviridae - каулимовирусы. Основанием для этого стало установление в конце 1970х годов структуры их генома, который представляет собой двунитевую ДНК размером от 7700 до 8300 пар нуклеотидов в зависимости от вида и рода, и клонирование этой ДНК на плазмидах Е. coli. Кроме того, изучение репродукции этих вирусов показало, что их ДНК обнаруживается в ядре растительной клетки в виде кольцевой ковалентно замкнутой суперскрученной молекулы, объединенной с нуклеосомными белками хозяйской клетки.

Эта ДНК транскрипционно активна и основными транскриптами являются РНК с константами седиментации 35S и 19S. Большая по размерам РНК (35S РНК) соответствует по длине всему геному вируса и служит матрицей для синтеза ДНК, которая может упаковываться в вирусные капсиды. Такой синтез осуществляется обратной транскриптазой, кодируемой вирусным геном. Наличие в геноме вирусов гена обратной транскриптазы и этапа обратной транскрипции в жизненном цикле сближает каулимовирусы с ретровирусами животных, из-за чего их объединяют в супергруппу параретровирусов.

В настоящее время известно более десятка каулимовирусов, способных поражать растения различных семейств класса Двудольные. Типовым для семейства и наиболее изученным вирусом является вирус мозаики цветной капусты, обозначаемый в литературе аббревиатурой CaMV (от его названия на английском языке – cauliflower mosaic virus).

Его геном схематично представлен на рис. 8.

Рис. 8. Схема генома вируса мозаики цветной капусты. Пояснения в тексте.

В вирусных частицах ДНК CaMV представляет собой кольцевую, но не ковалентно замкнутую молекулу. Кольцевой ее делает несколько так называемых избыточностей – однонитевых участков в одной из нитей (на рис. 6 они обозначены как 1, 2 и 3). После освобождения из вирусной частицы с помощью ферментов клетки-хозяина эти избыточности убираются, и молекула превращается в ковалентно замкнутую суперскрученную ДНК, пригодную для транскрипции. В ее составе имеются семь открытых рамок считывания (на рис. 4 обозначены римскими цифрами и широкими цветными линиями), кодирующих определенные белки. Рамка I несет информацию о белке, обеспечивающем перенос вирусных частиц по плазмадесмам из одной растительной клетки в другую, то есть системное распространение по растению. Рамки II и III кодируют протеины Р2 и Р3, которые отвечают за перенос вирионов тлями от растения к растению и называются факторами трансмиссии. Рамка IV соответствует предшественнику капсидных белков, рамка V – предшественнику протеиназы, обратной транскриптазы и РНКазы Н, которые нужны для построения ДНК на матрице 35S РНК.

Рамка VI кодирует белок телец включения, которые появляются в цитоплазме инфицированной растительной клетки и служат местом синтеза геномной ДНК и сборки вирусных частиц. Для белка, кодируемого рамкой VII, функции до сих пор не определены.

С точки зрения генетической инженерии особый интерес представляют две межгенные области (на рис. 4 выделены черным), в которых находятся промоторы 19S РНК (малая межгенная область протяженностью около 700 пар нуклеотидов) и 35S РНК (большая межгенная область – около 1500 пар нуклеотидов). Именно в эти области осуществляли вставки фрагментов ДНК с целью оценки возможностей использования каулимовирусов как векторных молекул для генетической трансформации растений.

Помимо межгенных областей пригодными для инсерций генетического материала без последующего нарушения цикла репродукции вируса являются рамки считывания II и III.

Успешными примерами экспрессии чужеродных для растений генов с вирусных векторов на основе каулимовирусов были перенос в растения турнепса бактериального гена дигидрофолатредуктазы (1984 год), гена неомицинфосфотрансферазы I из бактериального транспозона Tn903 и гена хлорамфениколацетилтрансферазы из бактериального транспозона Tn9 (1986 год) в растения табака, а также генов млекопитающих – гена металлотионеина (1987 год) и гена человеческого -интерферона (1989 год). Однако одновременно стало понятно, что с помощью таких векторов можно вводить в растения только небольшие (не более 300 пар нуклеотидов) фрагменты, и что полученные путем вирусной трансформации растения не способны передавать приобретенный признак в рядах поколений.

С появлением отработанных методов искусственного получения ДНК на матрицах РНК в круг потенциальных вирусных векторов для трансформации растений стали включать РНК-содержащие вирусы растений. Копии их геномов в виде комплементарных ДНК (кДНК), клонированные на стандартных бактериальных векторах, оказались пригодными для обычных генно-инженерных манипуляций, после которых с полученных гибридных молекул получают транскрипт и используют его для обработки растений.

Важным здесь является то, что для большинства изученных вирусов растений показана возможность так называемой механической инокуляции: при втирании суспензии молекул вирусного генома в ткани листа происходит инфицирование, в результате которого в клетках образуются вирусные частицы и далее системно распространяются по растению.

Наиболее широко используемыми в генетической инженерии растений являются вирус табачной мозаики (сокращенно ВТМ, в англ. аббревиатуре – TMV) и вирус мозаики коровьего гороха (ВМКГ или CPMV в англ. аббревиатуре).

Геном вируса табачной мозаики представляет собой одноцепочечную +РНК размером 6,4 т.п.н. и кодирует 4 белка: белок, обеспечивающий системное распространение, массой 30 кДа; белок оболочки (17,6 кДа) и две РНК-зависимые РНКполимеразы (126 кДа и 183 кДа). Причем обе РНК транскрибируются с одного и того же промотора, но для появления большей по размерам РНК-полимеразы транскрипция не останавливается на стоп-кодоне для меньшей, а продолжается до следующего стопкодона. Для реализации такой экспрессии необходимы шесть нуклеотидов (CAAUAA), расположенные сразу за стоп-кодоном AUG.

В геноме ВТМ нет межгенных областей, что не позволяет без ущерба для репродукции и системного распространения вируса проводить вставки самостоятельно экспрессируемых фрагментов нуклеиновой кислоты. Поэтому для работы с этим вирусом как вектором используют другую стратегию. Оболочка вирусной частицы ВТМ состоит из 2130 молекул одинакового белка, причем для сборки капсида более важными являются определенные его участки. Это и открыло возможности для введения небольших по размерам фрагментов в ген белка оболочки. Один из подходов в рамках этой стратегии – это удлинение белка за счет снятия терминирования транскрипции описанной в предшествующем абзаце последовательностью. Она была установлена сразу за стопкодоном белка оболочки и к ней присоединена последовательность, кодирующая пептид из 12 аминокислот – и нгибитор ангиотензипревращающего фермента млекопитающих, имеющий применение в лечении гипертонии. После введения такой конструкции в клетки табака и томатов около 5% белков оболочки содержали целевой пептид. По такой же схеме были получены варианты вирусов, в белках, оболочки которых на С-конце были закреплены антигенные детерминанты малярийного плазмодия, вируса гриппа и вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1).

В 1995 году при анализе структуры белка оболочки вируса табачной мозаики выявили небольшой участок, так называемую поверхностную петлю. При сборке вирусной частицы этот участок не задействован и экспонирован на поверхности капсида.

Встройка в этот район антигенной детерминанты малярийного плазмодия позволила создать химерный вирус, который после размножения в клетках растений очищали, и иммунизировали полученной суспензией лабораторных животных. Иммунный ответ, развивавшийся у животных, был сопоставим по эффективности с иммунным ответом на антиген малярийного плазмодия.

В 1999 году был реализован еще один подход, который позволяет получать большое количество свободного белка при экспрессии с вирусных векторов на основе ВТМ. Для этого сразу после промотора белка оболочки встроили полилинкер для вставки целевого гена и вслед за ним промотор из другого штамма ВТМ, с которого и транскрибируется собственно белок оболочки. Использование промотора из другого штамма снижает вероятность рекомбинационного выщепления вставки. C такого гибридного вектора TMVB экспрессировали полноразмерный белок VP1 вируса ящура, а не отдельные антигенные детерминанты в составе белка оболочки. Введение белкового экстракта листьев табака лабораторным животным вызывало развитие эффективного иммунного ответа против ящура. В 2004 году этот вектор был усовершенствован введением последовательности, кодирующей 7 остатков гистидина, которые будут прикреплены к Сконцу экспрессируемого белка. Это дает возможность эффективно очищать белок, пропуская экстракт белков из растения через колонку с никель-агарозой. С помощью такого вектора были получены очищенные препараты белка VP8 ротавируса крупного рогатого скота.

Векторы на основе вируса табачной мозаики используются на растениях из семейства Пасленовые. Вирус мозаики коровьего гороха репродуцируется в растениях семейства Бобовые. Его геном представлен двумя одноцепочечными молекулами РНК длиной 5,9 тысяч нуклеотидов (РНК1) и 3,5 тысяч нуклеотидов (РНК2). Пригодных для вставки участков генома в таких молекулах не имеется, поэтому и на этом вирусе основной стратегией является модификация белков оболочки путем встраивания антигенных детерминант возбудителей болезней. В отличие от вируса табачной мозаики ВМКГ имеет икосаэдрический капсид, который собирается из 60 молекул белка L (масса 37 кДа) и 60 молекул белка S (23 кДа). Пригодной для модификаций является расположенная в РНК2 последовательность VP23, кодирующая белок S. В этом белке имеется небольшая поверхностная петля, в пределы которой и возможны вставки без ущерба для сборки капсида. За период с 1993 по 2000 годы на векторах на основе вируса коровьего гороха были экспрессированы в растениях эпитопы риновируса и вируса иммунодефицита человека, вируса ящура и вируса энтерита норки.

Вирусные векторные системы на основе вируса табачной мозаики и технологии их применения были запатентованы в США (GenewareTM, корпорация LSBC – Large Scale Biology Corp., Калифорния) и в Европе (MagnICONTM, фирма Icon Genetics, Халле, Германия). Причем технология MagnICONTM является сочетанием агроинфекции и использования вирусных векторов: в листья растения вводится суспензия агробактерий, в клетках которых находится плазмида, несущая кДНК вирусного вектора с целевым геном.

Такая кДНК расположена между правым и левым концевыми повторами Т-ДНК, поэтому она переносится агробактериями в клетки паренхимы листа, после чего в них начинается репродукция гибридного вируса и его системное распространение по растению. Этот прием, называемый агроинфильтрация, дает возможность получения белков размером до 80 кДа в количестве порядка 5 граммов на 1 килограмм сырой растительной биомассы (около 50% общего растворимого белка). В 2010 году на основе этих технологий начато производство вакцин против ряда болезней, включая гепатит В и одну из форм лимфомы животных.

Из других вирусов растений в последнее десятилетие в качестве векторов пробовались Х-вирус картофеля (PVX), вирус мозаики бамбука (BaMV), вирус мозаики папайи (PapMV), вирус желтой карликовости бобовых (BeYDV), вирус мозаики люцерны (AlMV), вирус мозаики огурцов (CMV). Расширение круга потенциальных векторов связано с характерной для вирусов хозяйской специфичностью, которая практически отсутствует при использовании агробактериальных векторных систем.

Еще одним недостатком вирусных векторных систем является невозможность наследования растениями вносимой генетической информации в рядах поколений. Для получения целевого продукта необходимо каждый раз инфицировать уже выращенные растения и использовать их после системного распространения «нагруженного» вируса.

Кроме того, из-за опасности распространения генетически модифицированных вирусов в окружающую среду, все эти процедуры следует производить с соблюдением соответствующих мер безопасности. Но, как видно из разворачивающегося в последние годы практического применения, все это компенсируется значительно большим выходом целевых белков, чем при экспрессии генов, интегрированных в хромосомы растений.

Основой для еще одной группы потенциальных векторов, дающих множество копий вводимой генетической информации, могут стать близкие к вирусам вироиды. Они являются возбудителями болезней некоторых видов растений и представляют собой небольшие (от 246 до 399 нуклеотидов длиной) молекулы РНК. Эти РНК способны воспроизводиться в сравнимом с вирусами количестве копий и распространяться по растению при полном отсутствии капсида, что и привлекло к ним внимание специалистов по генетической инженерии.

РНК вироидов является однонитевой ковалентно замкнутой кольцевой молекулой, которая из-за комплементарности большей части последовательности представляет собой суперскрученную палочковидную структуру с небольшими шпилькообразными выступами (рис. 7).

Рис.7. Пространственная структура РНК представителей двух семейств вироидов. Cемейство Pospiviroidae: PSTVd – вироид веретенообразности клубней картофеля, HSVd – вироид карликовости хмеля. Семейство Avsunviroidae: PLMVd – вироид латентной мозаичности персика.

Эта РНК пригодна для использования в генно-инженерных манипуляциях по схеме, отработанной для вирусов растений с геномом, состоящим из однонитевых РНК. Важно и то, что инфицирование растений РНК вироидов легко осуществляется механической инокуляцией, например втиранием в листья.

Привлекательным с точки зрения генетической инженерии является и круг хозяев вироидов. В него входят как широко распространенные сельскохозяйственные растения (картофель, томаты, баклажан, яблоня, груша, слива, виноград), так и такие тропические и субтропические культуры, как кокосовая пальма, авокадо, цитрусовые, персик. Известны и вироиды, поражающие декоративные культуры – колеус и хризантемы.

К настоящему времени описаны 27 видов вироидов, принадлежащих к восьми родам и двум семействам. Самым обширным является семейство Pospiviroidae (23 вида), типовым для него признан наиболее изученный вироид веретенобразности клубней картофеля – PSTVd (от англ. potato spindle tuber viroid). Остальные виды входят в семейство Avsunviroidae, названное по типовому вироиду солнечного ожога (пятнистости) авокадо – ASBVd (от англ. avocado sunblotch viroid).

Существенно то, что вироиды могут передаваться в рядах поколений через пыльцу и семена, что выгодно отличает их от вирусов. Изучение биологических свойств вироидов, путей инфицирования ими растений-хозяев, механизмов их репродукции и распространения по растению продолжается, и вопрос о возможности их использования в качестве векторов, позволяющих существенно повышать дозу целевого гена в растении, пока не снимается с повестки дня.

Еще одним подходом в получении трансгенных растений с множеством копий вводимого гена является использование генома двумембранных органоидов.

Генетические конструкции для введения генетической информации в ДНК пластид О наличии ДНК в фотосинтезирующих органоидах клеток эукариот известно с 1961 года, исходной считается работа Х. Риса и В. Плаута по окрашиванию хроматофоров хламидомонад нуклеофильными красителями. Исследования пластид всех других видов растений различного уровня организации, проведенные в последующие годы, показали, что ДНК содержат все пластиды и что эта ДНК организована по прокариотическому принципу. Молекулы пластидных ДНК кольцевые ковалентнозамкнутые и в меньшей степени, чем ядерные ДНК, связаны с белками, причем эти белки отличны от гистонов, имеющихся в ядрах этих же клеток.

Число молекул ДНК в пластидах зависит от уровня организации растения: у хламидомонады около 50, у евглены – около 30, в пластидах покрытосеменных – около

100. Учитывая, что в зеленых клетках высших растений имеется несколько сотен хлоропластов, общее число копий пластидного генома может достигать 50 000. Это и определяет интерес к пластидному геному со стороны работающих в области генетической инженерии, поскольку открывает возможности для значительного увеличения копийности вводимых в клетки растений чужеродных генов.

Длина пластидных ДНК колеблется в пределах от 70 до 400 т.п.н. в зависимости от вида, но у большинства видов она составляет 120 – 220 т.п.н. Это соответствует приблизительно 150 белкам (наличие в хлоропластах гораздо большего количества разнообразных белков объясняется тем, что большая их часть кодируется ядерным, а не пластидным геномом). Кольцевые молекулы могут быть в форме моно-, ди-, три- и тетрамеров и это связывают с наличием в них как минимум двух инвертированных повторов (обозначаемых IRA и IRB), условно разделяющих всю молекулу на так называемые однокопийные районы (или фрагменты) – большой (обозначается LSC) и малый (SSC). Возможность рекомбинации по этим повторам, очевидно, и определяет формирование и распад коинтегратов. Установлено, что составляющие собственно повторы последовательности высоко консервативны и кодируют рибосомальные и транспортные РНК пластид, поэтому эти повторы есть практически у всех исследованных (а это более 1000) видов высших растений.

Стратегия введения в геном пластид целевых генов заключается в осуществлении гомологичной рекомбинации между вводимой ДНК и каким-либо участком в кольцевой молекуле пластид. Наиболее часто используемым для вставки районом пластидного генома является межгенный участок между кодирующими транспортные РНК генами trnI и trnA внутри оперона транспортных РНК.

Чаще всего для интеграции в этот район используют расположенную на плазмидах Е. coli генетическую конструкцию, включающую ген trnI, промотор гена 16S рибосомальной РНК из пластидной ДНК растений табака (обозначается Prrn), селективный ген aadA, полилинкер для встройки целевого гена и ген trnА. Каждый компонент этой конструкции выполняет свою функцию. Расположенные по краям trn-гены из пластидного генома создают гомологию для рекомбинационной замены. Конститутивно работающий промотор гена 16S рРНК обеспечивает высокий уровень экспрессии внутри хлоропластов всех после него стоящих генов (в хлоропластах работает оперонная система экспрессии).

Бактериальный ген aadA при экспрессии с этого промотора дает фермент аминогликозидаденилилтрансферазу, который аденилирует стрептомицин или спектиномицин, лишая тем самым их активности. Отбор трансформированных клеток или растений основан на том, что в присутствии стрептомицина (или спектиномицина) хлоропласты утрачивают способность синтезировать белки из-за связывания антибиотика с белками пластидных 70S-рибосом, вследствие чего растение на селективной среде теряют зеленую окраску.

Трансформированные растения на этой среде остаются зелеными, так как антибиотик в их клетках инактивируется.

Целевой ген в такой конструкции должен иметь на своем 5-конце регуляторный элемент для эффективной транскрипции в пластидах (5-RE), а на 3-конце – некодирующую последовательность из какого-либо хлоропластного гена для правильной трансляции на пластидных 70S-рибосомах (3-UTR). Чаще всего используются концевые последовательности генов psbA (одного из белков фотосистемы II), rbcL (большой субъединицы рибулозобифосфаткарбоксилазы), rps16 (одного из белков 70S-рибосом с константой седиментации 16S).

Кроме указанных генов в генно-инженерных конструкциях, предназначенных для введения генетической информации в пластидный геном, могут присутствовать другие элементы, используемые в соответствующих вышеописанных целях. Приведенная на рисунке 8 схема отражает основной спектр таких элементов.

–  –  –

Для получения трансгенного растения ДНК плазмиды с описанной выше конструкцией вводят либо методом бомбардировки (рис. 9), либо методом обработки протопластов смесью ДНК с полиэтиленгликолем (ПЭГ) (рис. 10).

Рис. 9. Этапы получения транспластомных растений табака (A – C) и салата-латука (D – F) после бомбардировки фрагментов растений частицами золота, несущими генно-инженерные конструкции для введения генов в пластидный геном (Из обзора Verma & Daniell, Plant Physiology, 2007, Vol. 145, pp.1129-1143).

Рис. 10. Проростки семян на среде со спектиномицином: LEC1-2.2 – транспластомных растений салата, WT – исходного сорта салата на среде, Ms 7 LEC1-2.2 – гибрида, полученного при опылении сорта салата Ms 7 (сорт с мужской стерильностью) пыльцой транспластомных растений LEC1-2.2 (Из статьи Lelivelt C.L.C. et al., Plant Molecular Biology, 2005, 58: 763-774).

Эффективность доставки «нагруженной» плазмиды в хлоропласты при использовании обоих методов не высока, но, благодаря тому, что в одной клетке около сотни хлоропластов, а в одном хлоропласте десятки копий молекул пластидной ДНК, отбор трансгенного растения оказывается возможным. При осуществлении рекомбинационной встройки вводимой генетической конструкции хотя бы в одну из копий пластидной ДНК на среде с антибиотиком происходит элиминация из клеток исходных пластид и постепенная замена их на устойчивые к антибиотику. Это видно по формированию зеленых регенерантов из неокрашенных изначально на среде с антибиотиком каллусов (рис. 9, фото А и D). В конечном итоге во всех клетках выросшего в таких условиях растения-регенеранта все пластиды несут целевой ген, то есть его количество достигает величин порядка 104 копий на клетку.

Полученные транспластомные растения (так называют растения со вставками чужеродных генов в пластидный геном) сохраняют введенный ген в рядах поколений, и определяемый этим геном признак при семенном размножении наследуется по материнской линии (рис. 10), то есть не передается с пыльцой.

Теоретически круг растений, пригодных для такой трансформации не ограничен.

Показано, что однодольные и двудольные растения трансформируются с приблизительно одинаковой эффективностью. Среди трансформированных растений, помимо модельных табака и арабидопсиса, зерновые (рис), овощные (томаты, картофель, морковь, цветная капуста, латук, кабачок), кормовые, пищевые и масличные (соя, рапс), технические (хлопок) культуры и древесные породы (тополь).

На способность к экспрессии в пластидах испробованы гены различного назначения.

Особое внимание в этих исследованиях уделяется тем генам, которые определяют признаки, зависящие от количества действующего белка. К таковым относятся гены энтомотоксинов, обеспечивающие устойчивость к насекомым-вредителям; гены, определяющие устойчивость к неблагоприятным почвенным и климатическим условиям;

гены, кодирующие белки медицинского назначения. С помощью переноса генов в хлоропластную ДНК возможно обеспечивать синтез в растениях таких веществ как природно деградируемый полимер поли--гидроксибутират и самый сладкий белок в мире монеллин. Во всех этих случаях повышение дозы гена (количества его копий в одной клетке) за счет пластидной локализации создает существенное преимущество по сравнению с интеграцией гена в ядерный геном.

Кроме того, при интеграции в пластидный геном показана экспрессия не отдельных генов, а оперонов, включающих несколько генов, чего не удается достигать при интеграции генов в хромосомную ДНК растений. Это было продемонстрировано при введении оперона из двух генов merA и merB из бактериального транспозона, обеспечивающего устойчивость к органическим и неорганическим солям ртути; и оперона из шести генов из морских светящихся бактерий Photobacterium leiognathi, обеспечивающего синтез флюоресцирующего белка в листьях трансформированного растения (рис. 10).

Рис. 10. Интеграция в пластидный геном табака Nicotiana tabacum lux-оперона.

Для экспрессии всех семи генов этой генно-инженерной конструкции оказалось достаточно одного промотора (на рис. 10 обозначен как Р), стоящего перед селективным геном aadA (его продукт обеспечивает устойчивость к спектиномицину и стрептомицину), и одной терминирующей последовательности (на рис. 10 обозначена как Т), стоящей в конце последнего гена lux-оперона – гена G. Свидетельством полноценной экспрессии является наблюдаемое в темноте свечение растений (рис. 11).

–  –  –

В 2013 году доктор доктор Александр Кричевский с предпринимателем Толом Эйдельбергом организовали фирму Bioglow, которая выставила на рынок первое коммерческое люминесцирующее растение Starlight Avatar (рис. 11).

Методы введения ДНК в растительные клетки Исторически сложилось так, что основным и наиболее часто используемым методом введения ДНК в растительный геном является описанная выше агроинфекция. Она применяется для получения растений, в которых вводимая последовательность стабильно интегрируется в ДНК хромосом.

При использовании векторных молекул на основе вирусов растений осуществляется механическая инокуляция – втирание в листовые пластинки суспензии молекул соответствующих нуклеиновых кислот. При этом приходится учитывать, что так называемая прямая трансформация клеток растений (проникновение молекул нуклеиновых кислот через оболочку клетки без участия бактерий или вирусных частиц) существенна затруднена. Основным препятствием на пути молекул ДНК или РНК является клеточная стенка. Ее химический состав и особенности расположения составляющих ее компонентов способствуют связыванию молекул нуклеиновых кислот, ограничивая тем самым доступ их к мембране клетки. Однако при механической инокуляции достаточным оказывается проникновение даже очень небольшого количества молекул нуклеиновой кислоты вируса-вектора в отдельные клетки, поскольку далее начинается системное распространение векторных молекул такого типа по растению за счет формирующихся в первично зараженных клетках вирусных частиц.

В случае же использования невирусных векторов, например, несущей целевой ген бактериальной плазмидной ДНК, эффективность прямой трансформации оказывается очень низкой. Проводимые в 1970-1980-е годы эксперименты по введению суспензий молекул ДНК в завязи цветков или молодые цветочные побеги с помощью шприца (макроинъекции), замачиванию сухих семян растений или пыльцы в подобных растворах, применению электрофореза для усиления проникновения ДНК в ткани проростков показали, что частота образования трансформантов при воздействии на целостные клетки не соответствует запросам исследователей. Поэтому были опробованы методы введения ДНК в протопластированные (лишенные клеточной стенки) растительные клетки.

Для удаления клеточной стенки растительных клеток применяют комплекс ферментов грибного или бактериального происхождения, состоящий из пектинлиаз и целлюлаз. Полученные протопласты при обработке их растворами ДНК трансформируются, но частота образования трансформантов остается невысокой. Это послужило основанием для поиска химических и физических способов повышения трансформационной компетентности протопластов растительных клеток.

Было установлено, что повышение значений рН растворов до 10 и присутствие в трансформирующих растворах дивалентных ионов (Са2+, Mg2+, Zn2+ и Cu2+) повышает частоту трансформации. Считается, что положительное действие таких ионов и щелочных значений рН проявляется не столько на уровне изменения проницаемости мембран, сколько на уровне ингибирования активности нуклеаз растительных клеток, разрушающих ДНК как внутри протопласта, так и в растворе, куда они попадают при разрушении части протопластов.

Более существенное повышение частот трансформации было достигнуто при использовании органических соединений. Одним из самых эффективных методов прямой трансформации протопластов к настоящему времени стала обработка протопластов растительных клеток смесью соответствующих векторных молекул и полиэтиленгликоля. Полиэтиленгликоль (ПЭГ) представляет собой сильно гидрофильное вещество и способен связывать много свободной воды в растворе. Таким образом, при высоких концентрациях ПЭГ такие макромолекулы, как ДНК, не могут оставаться в растворе и осаждаются. Мембрана протопласта в норме отрицательно заряжена. Благодаря фосфатным группам ДНК тоже имеет отрицательный заряд, и, следовательно, взаимное отталкивание зарядов препятствует взаимодействию между ДНК и протопластами. При концентрациях 15-40% ПЭГ минимизирует взаимное отталкивание зарядов; таким образом, клеточные мембраны могут прийти в тесный контакт с ДНК.

Кроме того, ПЭГ представляет собой и сильный стимулятор эндоцитоза у протопластов растений. Таким образом, общий механизм воздействия ПЭГ связан с преципитацией, т.е.

осаждением плазмидной ДНК на плазматической мембране и затем стимуляцией ее поглощения путем эндоцитоза.

Многие другие гидрофильные полимеры с длинной цепью (например, поливиниловый спирт), длинноцепочечные катионы (например, поли--орнитин, поли-лизин) тоже используются для стимуляции поглощения ДНК. В отличие от остальных веществ ПЭГ гораздо менее токсичен по отношению к большинству протопластов, и, как правило, можно подобрать такую концентрацию, при которой достигается хороший уровень поглощения ДНК при незначительно повреждении клеток. При обработке плотной суспензии протопластов (порядка 106 на 1 мл) растворами, содержащими 5 мкг ДНК векторной плазмиды и ПЭГ6000 (или ПЭГ4000) с концентрациями в интервале 15происходит поглощение одним протопластом до 1000 молекул плазмидной ДНК.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Похожие работы:

«ООО "ЕВРОТЕРМИНАЛ"ПЛАН ДЕЙСТВИЙ В ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ И СОЦИАЛЬНОЙ СФЕРЕ (ESAP) Проект создания морского терминала, удалнного от моря Подготовил: Михаил Ваненков 9/21/2009 ПЛАН ДЕЙСТВИЙ В ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ И СОЦИАЛЬНОЙ СФЕРЕ (ESAP), 2009 Требования "ЕВРОТЕРОтветственПлан законодательства МИНАЛ" / ность / рекомендации план-график Потенциа...»

«РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова Факультет почвоведения УТВЕРЖДАЮ Программа учебной практики Учение об атмосфере Направление подготовки №022000 Экология и приро...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ГИДРОМЕТЕОРОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ PR КАК ИНСТРУМЕНТ УСТОЙЧИВОГО РАЗВИТИЯ МАТЕРИАЛЫ МЕЖДУНАРОДНОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЙ КОНФЕРЕНЦИИ...»

«Государственная система санитарно-эпидемиологического нормирования Российской Федерации 4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ Гигиеническая оценка сроков годности пищевы...»

«ЗАКОН РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН О ГЕОГРАФИЧЕСКИХ УКАЗАНИЯХ (в редакции Закона РТ от 03.07.2012г.№855) Настоящим Законом регулируются отношения, возникающие в связи с правовой охраной и использованием географических ука...»

«002-12-00130 АКТ ЭКСПЕРТИЗЫ № На постоянную номенклатуру производства для оформления сертификатов происхождения товара (форма СТ-1) (Срок действия акта экспертизы – один год – по 05.02.2018г.) 1. Эксперт: Бганцева Т.А. 2. Дата составления акта: 06.02.2017г.3. Основание для пр...»

«Министерство здравоохранения Российской Федерации Федеральное медико-биологическое агентство ФГБУ НИИДИ ФМБА России Северо-Западное отделение РАМН Комитет по здравоохранению Правительства Санкт-Петербурга Комитет по...»

«Институт экологии и природопользования Миссия и цели Института Миссия нашего Института – подготовка конкурентоспособных кадров, востребованных не только в Республике Татарстан и в России, но и за рубежом. Получение образования в наш...»

«Дисбиоз. Зачем и как бороться? Александрович Н.Ж. В течение последнего десятилетия мы очень часто говорим, пишем и читаем о дисбактериозе или дисбиозе. Что же это такое? И почему он стал играть такую большую роль в нашей жизни, так ощутимо влиять на наше самочувствие? Впервые т...»

«Министерство природных ресурсов и экологии Российской Федерации Федеральное агентство по недропользованию ФГУГП "Гидроспецгеология" Центр мониторинга состояния недр на предприятиях Госкорпорации "Росатом" Методические рекомендации по ведению объектного мониторинга состояния недр на предприятиях Госкорпорации "Р...»

«Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной экологии. 2010. – Т. 19, № 2. – С. 122-150. УДК 582.29 ФЛОРИСТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ОСОБО ЦЕННОГО КРАСНОСАМАРСКОГО ЛЕСНОГО МАССИВА САМАРСКОЙ ОБЛАСТИ: II. ЛИШАЙНИКИ © 2010 Е.С. Корчиков* Самарский государственный ун...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Нижегородский гос...»

«Утверждены Решением Комиссии таможенного союза от 18 ноября 2010 г. N 455 ЕДИНЫЕ ФОРМЫ ВЕТЕРИНАРНЫХ СЕРТИФИКАТОВ Форма N 1 (1) ТАМОЖЕННЫЙ СОЮЗ (2) _ (наименование уполномоченного органа в области ветеринарии государств...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "КАРАЧАЕВО-ЧЕРКЕССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени У.Д. АЛИЕВА" Кафедра биологии и химии "Утверждено" на заседании кафедры биологии и химии Протокол № _ от "_" _ 20_ г....»

«1. ТРЕБОВАНИЯ К ГОСУДАРСТВЕННОМУ ЭКЗАМЕНУ ДЛЯ СТУДЕНТОВ, ОБУЧАЮЩИХСЯ ПО НАПРАВЛЕНИЮ ПОДГОТОВКИ 38.03.02. "МЕНЕДЖМЕНТ"1.1. Нормативно правовая база В соответствии с Федеральным Законом Российской Федерации от 21.12.2012 № 273-ФЗ "Об образовании в РФ" (вступил в силу с 1.09.2013 года), Федеральным...»

«СОВРЕМЕННЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ПОВЫШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ УДК 664.64.016 Бачинская Я.О., канд. с.-х. наук, Непочатых Т.А., канд. техн. наук, доц. (ХТЭИ КНТЭУ, Харьков) ИССЛЕДОВАНИЕ КАЧЕСТВА ХЛЕБОБУЛОЧНЫХ ИЗДЕЛИЙ И ПОВЫШЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ БУЛОК ГОРОДСКИХ за СЧЕТ ВВЕДЕНИЯ ШРО...»

«МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ Волгоградский государственный медицинский университет Кафедра анестезиологии и реаниматологии с трансфузиологией ФУВ "УТВЕРЖДАЮ" Декан ФУВ " " 2017 г...»

«ДУБЫНИНА Елена Вячеславовна РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ НЕЙРОТРОФИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ В ГИППОКАМПЕ КРЫСЫ АЛЬФА-МЕЛАНОКОРТИНОМ И ЕГО АНАЛОГАМИ 03.00.13 физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2009. Работа выполнена в Лаборато...»

«Министерство образования и науки РФ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Ульяновский государственный университет" Н. А. Курносова, М. А. Семенова ЗАКОНОМЕРНОСТИ НАСЛЕДОВАН...»

«Муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение детский сад комбинированного вида № 8 "Снеговичок" Дидактические игры по экологическому воспитанию для детей среднего дошкольно...»

«E4351 V2 Public Disclosure Authorized CASA-1000: Проект Передачи и Торговли Электроэнергией в Центральной и Южной Азии Краткое содержание Региональной Экологической Оценки Национальная Компания по Электропередаче и Доставке (Пакистан) Открытая Акционерная Холдинговая К...»

«УДК 636.2: 637.112 СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ПРИ ОРГАНИЗАЦИИ РАЗДОЯ КОРОВ НА СОВРЕМЕННЫХ ВЫСОКОИНТЕНСИВНЫХ ФЕРМАХ В.П. СЛАВОВ НААНУ Житомирский национальный агроэкологический университет А.П. СЛАВОВ, Н.В. РЫБИЙ Институт животноводства НААН Украины Постановка пробле...»

«Министерство экологии и природных ресурсов Нижегородской области Нижегородское отделение Союза охраны птиц России Экологический центр "Дронт" Нижегородский государственный педагогический университет им. Козьмы Минина Г УСЕОБРАЗНЫЕ И ДРУГИЕ ВОДОПЛАВАЮЩИЕ ПТИЦЫ НИЖЕГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ...»

«30.07.-03.08.12 Подготовлено Департаментом маркетинга ЗАО "Колакс-М" Оглавление 1. МСХ РФ..3 2. КОЛАКС..4 3. Регионы..5-7 4. Мероприятия..8 5. Технологии..9 6. Новое (фермы, производства, оборудование и т.д.).10 7. Конкурсы..11 8. Зарубежье..12 9. Интересно...»

«УДК 338.14 Вусов Александр Владимирович Vusov Alexandr Vladimirovich аспирант Московской финансово-промышленной PhD student, Moscow University академии МФПУ "Синергия", for Industry and Finance Synergy руководи...»

«СОГЛАШЕНИЕ МЭРОВ ПО КЛИМАТУ И ЭНЕРГИИ Мы, Мэры, подписывающие это Соглашение, разделяем видение устойчивого будущего – независимо от размеров нашего муниципалитета и его расположения на карте мира. Это общее видение...»

«Экологические сказки Экологические сказки Сказка входит в жизнь ребенка с самого раннего возраста, сопровождает на протяжении всего дошкольного детства и остается с ним на всю жизнь. Со сказки начинается его знакомство с миром литературы, с миром человеческих взаимоотношений и со всем окружающим миром в целом. Необходимо о...»

«УСТИНОВА АЛИСА СЕРГЕЕВНА РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ СБРАЖИВАНИЯ ВЫСОКОКОНЦЕНТРИРОВАННОГО СУСЛА ИЗ ЯЧМЕНЯ Специальность 05.18.07 – Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Санкт-Пете...»










 
2017 www.book.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.