WWW.BOOK.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные ресурсы
 
s

«Разработка технологии производства субстанций терапевтических вакцин против заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека 6/11 и 16/18 типов ...»

На правах рукописи

ЛЕОНОВ Вячеслав Сергеевич

Разработка технологии производства

субстанций терапевтических вакцин против

заболеваний, ассоциированных с вирусом

папилломы человека 6/11 и 16/18 типов

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 2015

Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИгенетика»).

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Хамитов Равиль Авгатович

Официальные оппоненты:

Птицын Леонид Романович - доктор биологических наук, доцент, ЗАО «Научноисследовательский институт Аджиномото-Генетика», лаборатория № 6, заведующий, +7 (495) 780-32-66, e.mail: leonid_ptitsyn@agri.ru.

Колышкин Владимир Михайлович - доктор биологических наук, ФГУП «СанктПетербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов» ФМБА России, советник директора, +7 (915) 015-92-15, e.mail: vkolyshkin@rambler.ru.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова», +7 (495) 917-49-00, e.mail: info@instmech.ru, http://www.instmech.ru.

Защита состоится «22» апреля 2015 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.042.01 при ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» по адресу: 109472, г.

Москва, ул. Академика Скрябина, 23; тел. (495) 337-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО МГАВМиБ (109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23) и на сайте http://www.mgavm.ru.

Автореферат разослан «____» ___________ 2015 г. и размещен на сайте http://www.vak.ed.gov.ru.

Ученый секретарь диссертационного совета, Грязнева Т.Н.

профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Вакцины против ВПЧ 6/11 и 16/18 типов широко применяются в медицине для профилактики таких заболеваний, как рецидивирующий респираторный папилломатоз, аногенитального кондиломатоз и рак шейки матки.

К настоящему моменту в мире существуют две эффективные профилактические вакцины против ВПЧ – квадривалентная вакцина Гардасил и бивалентная вакцина Церварикс. Терапевтических вакцин для иммунотерапии заболеваний, ассоциированных с ВПЧ 6/11 и 16/18 типа в мире не существует.

Согласно патентам и ряду научных работ (RU2282461, RU2290204) в качестве активного компонента терапевтических вакцин против ВПЧ может использоваться гибридный рекомбинантный белок, состоящий из слитых последовательностей онкобелка Е7 ВПЧ и белка теплового шока 70 кДа Mycobacterium tuberculosis.

Выбор раннего белка Е7 в качестве мишени обусловлен его ключевой ролью в жизненном цикле вируса и способностью конститутивно экспрессироваться в пораженных вирусом эпителиальных клетках. Он способен влиять на дифференциацию и пролиферацию инфицированных клеток [Сахарова О.В., 1999]. Постоянный синтез белка E7 необходим для поддержания опухолевого фенотипа инфицированных клеток, а их ингибирование приводит к регрессии ВПЧ-обусловленного заболевания.





Известно, что вирусами папилломы не инфицируются антигенпрезентирующие клетки (АПК), избегая тем самым прямого пути активации иммунитета. У больных ВПЧ-ассоциированными заболеваниями регистрируется очень слабый иммунный ответ на эти белок E7 [Benton С., 1992]. Иммуногенность белка Е7 в составе терапевтических вакцин увеличена за счет присоединения к нему белка теплового шока HSP70 Mycobacterium tuberculosis, который активирует антигенпрезентирующие клетки и участвует в процессинге антигена [Khlebodarova T.M., 2002].

У крупного рогатого скота, лошадей и кроликов довольно часто наблюдаются папилломы (бородавки) кожи, слизистых оболочек ротовой полости и наружных половых органов. Чаще всего папилломы возникают в области головы, шеи, на сосках и вымени, особенно у молодых и высокопродуктивных коров [Э.И. Веремей, 2006].

Вакцинирование крупного рогатого скота белком E7 4 типа бычьего папилломавируса замедляет рост папиллом, индуцируя их регресс, который сопряжен с сильным клеточным иммунным ответом. Вакцинированный скот вырабатывает антитела против E7 и производит E7-специфичные Т-клетки [Campo M.S., 1993]. Ветеринарная вакцина на основе гибридного белка, состоящего из белка E7 и белка теплового шока HSP70, может обладать еще большей эффективностью.

При производстве вакцины Гардасил в качестве продуцента используется рекомбинантный штамм Saccharomyces cerevisiae, экспрессирующий растворимый капсидный белок L1 соответствующего серотипа в количестве 300-400 мг/л, а при производстве Церварикса – линия генномодифицированных клеток насекомых, экспрессирующая капсидный белок L1 в количестве 100-200 мг/л культуральной жидкости [Cook J.C., 1999].

Продуценты для производства компонентов терапевтической вакцины имеют более низкую продуктивность. Кроме того, для терапевтической вакцины против ВПЧ необходимы дозировки активных компонентов, пятикратно превышающие используемые в профилактических вакцинах.

Для создания эффективной и коммерчески рентабельной технологии производства отечественной терапевтической вакцины, которая могла бы сравниться с зарубежными технологиями, необходимо обеспечить продуктивность процесса культивирования сравнимую или большую, чем у зарубежных аналогов. Разработка и реализация на практике эффективной технологии производства отечественных вакцин против ВПЧассоциированных заболеваний является актуальной задачей.

Цель и задачи исследований. Целью настоящего исследования являлась разработка технологии производства двух терапевтических вакцин для иммунотерапии заболеваний, ассоциированных с ВПЧ 6/11 и 16/18 типов, на основе 4-х гибридных рекомбинантных белков E7 ВПЧ соответствующего серотипа и белка теплового шока HSP 70 Mycobacterium tuberculosis.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать универсальный способ культивирования рекомбинантных штаммов SCR-702-Е7(6)-HSP70, SCR-702-Е7(11)-HSP70, SCR-702-Е7(16)-HSP70 и SCR-702Е7(18)-HSP70, созданных на основе штамма-реципиента S. сerevisiaeD702 и экспрессионного вектора pPDX3U-Е7-HSP70, продуцирующих гибридные белки E7(6)-HSP70, E7(11)-HSP70, E7(16)-HSP70 и E7(18)-HSP70.

2. Создать математическую модель стадии биосинтеза целевого белка E7(16)HSP70, позволяющую прогнозировать выходные параметры процессов культивирования.

3. Разработать способ дезинтеграции биомассы штаммов-продуцентов SCR-702Е7(11)-HSP70, SCR-702-Е7(6)-HSP70, SCR-702-Е7(16)-HSP70 и SCR-702-Е7(18)- HSP70.

4. Создать на основе полученных субстанций готовые лекарственные формы двух терапевтических вакцин против рецидивирующего респираторного папилломатоза, аногенитального кондиломатоза и против рака шейки матки.

5. Разработать опытно-промышленные регламенты на производство вакцин против заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека.

Научная новизна. Впервые в России создана математическая модель стадии биосинтеза целевого белка E7(16)-HSP70, позволяющая оптимизировать процесс культивирования. Рассчитанная по математической модели двухстадийная подпитка лимитирующим компонентом позволяет максимизировать объемную продуктивность и прогнозировать выходные параметры процесса культивирования. Оптимизированная двухстадийная подпитка состоит из подпитки по экспоненциальному закону при удельной скорости роста 0,08 ч-1 и подпитки с расходом, рассчитанным по оптимальному постепенно снижающемуся профилю скорости роста, вычисленному с применением методов вариационного исчисления, а именно уравнений Эйлера-Лагранжа.

Впервые в России разработана универсальная технология промышленного культивирования штаммов, созданных на основе штамма-реципиента S. сerevisiae D702 и экспрессионного вектора pPDX3U-Е7-HSP70, продуцирующих гибридные рекомбинантные белки E7(6)-HSP70, E7(11)-HSP70, E7(16)-HSP70 и E7(18)-HSP70.

На основании разработанного способа культивирования подана заявка на патент РФ №2013146057 на изобретение «Способ микробиологического синтеза гибридного белка Е7(6)-HSP70 или Е7(11)-HSP70 или Е7(16)-HSP70 или Е7(18)-HSP70», принято решение Роспатента о выдаче патента (приоритет от 16.10.2013).

Практическая значимость. Разработанная технология использована в производстве ГЛФ вакцин для проведения доклинических испытаний и исследований стабильности в рамках государственных контрактов № 16.N08.12.1024 и № 13411.1008799.13.173 от Минобрнауки и Минпромторга России.

Разработаны и утверждены опытно-промышленные регламенты на производство терапевтических вакцин под № 00479942-03-14 и № 00479942-01-15.

Произведены опытные серии двух терапевтических вакцин против рецидивирующего респираторного папилломатоза, аногенитального кондиломатоза и против рака шейки матки, прошедшие контроль согласно ФСП.

Личный вклад соискателя. Автор выполнял работу по созданию и характеризации клеточных банков культур, исследованию ростовых и продуктивных свойств штаммов-продуцентов, разрабатывал способ культивирования штаммов-продуцентов, разрабатывал математическую модель процесса биосинтеза, способ дезинтеграции биомассы, осветления клеточного лизата. Самостоятельно выполнял работы по масштабированию процессов культивирования, дезинтеграции и проведению установочных серий. Разработка методики очистки целевых белков выполнялась совместно с Селищевым С.В. Разработка способа получения фармацевтических субстанций и ГЛФ терапевтических вакцин, контроль стабильности проводились совместно с Жученко М.А. Нормативная документация на производство вакцин разрабатывалась совместно с Кухаренко А.Е.

Штаммы-продуценты были получены в лаборатории эукариотических систем экспрессии генов под руководством. Козлова Д.Г (ФГУП ГосНИИгенетика), за что выражаю ему глубокую благодарность.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты исследований доложены на межлабораторном семинаре сотрудников ФГУП «ГосНИИгенетика» (Москва, 2014).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 3 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК, подана 1 заявка на патент.

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 190 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практическое использование результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список литературы (221 источников, из них 180 иностранных авторов). Диссертация включает 48 рисунков, 20 таблиц, 22 страницы приложений.

На защиту выносятся следующие положения и результаты:

1. Промышленная технология, основанная на использовании штамма-реципиента Saccharomyces cerevisiae D702 и экспрессионного вектора pPDX3U-Е7-HSP70, базирующаяся на двухстадийном культивировании с оптимизированными подпитками, обеспечивает получение целевых рекомбинантных белков E7(16)-HSP70, E7(18)HSP70, E7(11)-HSP70 и E7(6)-HSP70 для изготовления терапевтических вакцин против заболеваний, ассоциированных с ВПЧ 16/18 и 6/11 типов, с продуктивностью не менее 180,0 ± 17,5 мг, 692,4 ± 72,1 мг, 425,1 ± 35,3 мг, 395,0 ± 43,2 мг очищенного белка с 1 л культуральной жидкости, соответственно.

2. Математическая модель стадии биосинтеза целевого белка E7(16)-HSP70 позволяет путем использования оптимизированного профиля подпитки лимитирующим компонентом увеличить объемную продуктивность полунепрерывных процессов культивирования штаммов-продуцентов SCR-E7(16)-HSP70, SCR-E7(18)-HSP70, SCRE7(11)-HSP70 и SCR-E7(6)-HSP70, соответственно, в 16,7 раз, в 9,4 раз, в 10,6 раза и в 10,2 раза по сравнению с периодическим процессом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в 2012 - 2014 гг. на базе ФГУП "ГосНИИгенетика". Вакцины для проведения доклинических испытаний получены по разработанной технологии в Отделе Медицинской Биотехнологии (ОМБ) ФГУП "ГосНИИгенетика". Анализ субстанций целевых белков проведен в лаборатории физико-химического контроля ОМБ ФГУП "ГосНИИгенетика".

Микроорганизмы. В работе использованы штаммы Saccharomyces cerevisiae SCRE7(6)-HSP70, SCR-E7(11)-HSP70, SCR-E7(16)-HSP70, SCR-E7(18)-HSP70 продуценты гибридных белков E7(6)-HSP70, E7(11)-HSP70, E7(16)-HSP70, E7(18)-HSP70 (депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номерами Y-3919, Y-3853, Y-4057, Y-4058, соответственно).

Питательные среды, растворы и реактивы. При проведении работы использованы компоненты питательных сред, минеральные соли, реагенты для биохимии производства Аmresco, Sigma Aldrich, Panreac, Merck, сорбенты Imac 6 FF (GE Healthcare), QHP Sepharose (GE Healthcare) и Superdex 200(GE Healthcare).

Методы исследований. Культивирование штаммов-продуцентов проводили в ферментере Biostat C30 (BBI, Германия) общим объемом 42 л в объеме жидкой питательной среды от 10 л до 30 л. В процессе культивирования контролировали концентрацию растворенного кислорода в среде, величину рН, температуру процесса, объемную подачу воздуха, перемешивание. В ходе процесса культивирования в среду асептически вносили подпитки – стерильные растворы сахарозы, глюкозы, глицерина, дрожжевого экстракта, казаминовых кислот, фосфатов. Продолжительность процесса составляла 36-65 ч. Клеточная плотность культуральной жидкости в процессе культивирования определялась измерением абсолютно сухого веса (АСВ) клеток из расчета на 1 л культуральной жидкости в анализаторе влажности Sartorius MA 150 (Германия).

Дезинтеграция биомассы и осветление лизата. Биомассу продуцента размораживали в течение 6 часов при температуре +4оС и диспергировали в лизирующем буфере ЛБ (100 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 30 мM имидазол, 500 мМ NaCl, 4 M мочевины, 0.1 % полисорбата 20, 1 мM EDTA, 5 мМ дитиотрейтола, 2 мМ PMSF, pH 8.0) в соотношении биомасса: буфер 1:3. Суспензию клеток разрушали в дезинтеграторе APV 1000 (APV, Дания) при давлении 950 бар с последующим охлаждением в теплообменнике до температуры 8-10оС. Общее число циклов дезинтеграции определялось результатами фазово-контрастной микроскопии (Carl Zeiss Axiostar, Германия), т.е. не менее 95% клеток должно было быть разрушено.

Биохимическая очистка. Очистку проводили на хроматографе AKTA Purifier 100 (GE Healthcare) с применением металл-хелат аффинной, ионообменной и гельфильтрующей хроматографии.

Измерение удельной продуктивности. Для анализа использовали образцы культуральной жидкости продуцента гибридного белка, нормированные из расчета, чтобы 1 мл образца имел АСВ 10 мг. Образец биомассы с 150-200 мг стеклянных шариков и 0,1 мл лизирующего буфера дезинтегрировали в аналитическом дезинтеграторе Bullet Blender (Next Advance, США). Затем определяли содержание растворимого гибридного белка в полученном супернатанте методом электрофореза в 8% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли в восстанавливающих условиях. Оценка электрофореграмм и расчет выхода целевого продукта проводился с использованием программного обеспечения Gene Tools (Syngene, Англия).

Определение концентрации глюкозы и глицерина в культуральной жидкости.

Образец культуральной жидкости продуцента гибридного белка осаждали при 4000 об/мин в течение 15 мин. В супернатанте определяли содержание аналита методом ВЭЖХ на аналитическом хроматографе Ultimate 3000 (Dionex, США) на колонне YMC Polyamine II. В качестве стандартов использовали растворы глюкозы и глицерина в концентрации 5 мг/мл.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка технологии производства терапевтических вакцин против заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека 6/11 и 16/18 типов Технология получения двух терапевтических вакцин против заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека 6/11 и 16/18 типов, основана на получении в клетках 4-х рекомбинантных штаммов-продуцентов S. cerevisiae 4-х гибридных рекомбинантных белков, состоящих из слитых последовательностей онкобелка Е7 ВПЧ соответствующего типа (6, 11, 16 или 18) и белка теплового шока 70 кДа Mycobacterium tuberculosis, дальнейшей дезинтеграции биомассы штаммовпродуцентов, выделении и очистке целевых белков из клеточных лизатов, а также сорбции целевых белков на адъювант.

Структура гибридного рекомбинантного белка, состоящего из слитых последовательностей онкобелка Е7 ВПЧ соответствующего типа и белка теплового шока 70 кДа Mycobacterium tuberculosis приведена на рисунке 1.

–  –  –

Рис. 1. Структура гибридного рекомбинантного белка Е7-HSP70 Целевые белки экспрессируются в штаммах-продуцентах Е7-HSP70 при отсутствии в среде углеродсодержащих субстратов (сахарозы и глюкозы). Присутствие в среде несбраживаемых углеродсодержащих субстратов (таких как глицерин и этанол) не препятствует синтезу целевого белков.

Обоснование общей стратегии процесса культивирования Промотор Gal1, под контролем которого находится синтез белка E7-HSP70, не обладает галактозозависимой индукцией, но по своей сути является индуцируемым. В случае индуцибельного промотора процесс культивирования делится на две части – этап накопления биомассы и этап биосинтеза целевого белка.

Стадия накопления биомассы должна проводиться с использованием сахара в качестве углеродсодержащего субстрата. Культура должна максимально эффективно использовать углеродсодержащий субстрат и накопить большой пул биомассы за минимальное время, т.е. экономический коэффициент YXS и объемная производительность по биомассе QX должны быть максимальными.

Стадия биосинтеза должна пройти с максимально большой объемной продуктивностью целевого белка QP и, соответственно, QP является основным параметром оптимизации и математического моделирования стадии биосинтеза.

–  –  –

Продуктивность и ростовые свойства штаммов-продуцентов были оценены в периодическом процессе культивирования в объеме питательной среды 10 л. В таблице 1 приведены данные по продуктивности штаммов.

–  –  –

Самую низкую продуктивность показал штамм-продуцент SCR-702-E7(16)-HSP70.

Было решено проводить исследования и оптимизацию процесса на этом модельном штамме, а затем апробировать разработанную схему на остальных штаммах.

Разработка этапа накопления биомассы Ферментационная стратегия культивирования продуцентов осложнена наличием Крэбтри-эффекта, при котором внесение относительно малых порций сахарозы в культуру приводит к запуску процесса брожения, мгновенному образованию этанола и потере контроля над ведением процесса.

В ходе разработки этапа накопления биомассы были исследованы и подобраны оптимальные параметры процесса: состав среды культивирования, режим подачи углеродсодержащего субстрата, температура процесса, аэрация и уровень растворенного кислорода в среде, величина pH и другие.

Остановимся подробнее на выборе режима подачи углеродсодержащего субстрата.

Штаммы-продуценты Е7-HSP70 являются Крэбтри-положительными. Эта особенность штаммов ведет к брожению, снижению выхода биомассы, нецелесообразному расходу субстрата, и, главное, неуправляемому росту культуры, поэтому одной из задач этого этапа являлась его минимизация.

Исследованы 3 режима подачи углеродсодержащего субстрата:

1. Периодический процесс – весь субстрат вносится в начале процесса. Культура последовательно проходит стадии брожения и аэробной ферментации.

2. Периодический процесс совместно с подпиточным – часть субстрата вносится в начале процесса, а после окончания брожения начинается подпиточный процесс, в котором субстрат подается в лимитирующих количествах.

3. Подпиточный процесс – субстрат подается с постоянной скоростью с начала культивирования.

На рисунке 2 приведены кривые роста штаммов-продуцентов в процессах с различными режимами подачи углеродсодержащего субстрата.

25 111013, стартовая сахароза - 30 г/л 250414, постоянная АСВ, г/л

–  –  –

Рис. 2. Кривые роста штаммов-продуцентов SCR-702-E7-HSP70 в процессах с различными режимами подачи углесодержащего субстрата В таблице 2 показаны выходные параметры процесса накопления биомассы с различными режимами подачи углеродсодержащего субстрата.

–  –  –

При реализации 3 режима культура штамма-продуцента белка E7(16)-HSP70 очень быстро переходила от дыхательного метаболизма к метаболизму брожения и обратно, такого рода осцилляции приводили к снижению скорости роста и продуктивности. Для других штаммов этот режим показал достаточно высокую эффективность.

Особенности роста культуры SCR-702-E7-HSP70 при индукции синтеза целевого белка глицерином. При синтезе многих рекомбинантных белков удельная скорость образования продукта qp является функцией удельной скорости роста культуры или qp= f().

На рисунке 3 показаны кривые удельной скорости роста культуры на этапе биосинтеза при внесении глицерина в различных точках. Наблюдаемые при этом пилообразные колебания удельной скорости роста приводят к колебаниям удельной скорости образования продукта qP, вследствие чего снижается общая объемная продуктивность процесса QP, и увеличивается продолжительность процесса культивирования.

А Б -1

-2

–  –  –

При использовании лимитированной подпитки по глицерину вместо однократного внесения пилообразный вид кривой удельной скорости роста сохранялся.

Для дальнейшей оптимизации стадии биосинтеза необходимо иметь метод управления скоростью роста культуры.

Определение лимитирующего компонента в ходе стадии биосинтеза при культивировании штамма SCR-E7(16)-HSP70. Мы предположили, что в ходе процесса имеется некий неизвестный нам лимитирующий компонент, который и обуславливает такой характер колебаний скорости роста. Для его определения была поставлена ферментация, в ходе которой после внесения глицерина поочередно вносили предположительно лимитирующие компоненты.

На рисунке 4 показано их влияние на потребление кислорода культурой. Внесение дигидрофосфата калия резко ускорило рост культуры, что отразилось на наклоне кривой аэрации. Таким образом, лимитирующим компонентом в данной комплексной среде является дигидрофосфат.

Рис. 4. Изменение потребления кислорода культурой штамма SCR-E7(16)HSP70 в ходе внесения добавок (А). Удельная скорость роста и удельная продуктивность при культивировании штамма SCR-E7(16)-HSP70 с комплексной подпиткой фосфатами, дрожжевым экстрактом и казаминовыми кислотами (Б) Для проверки этого предположения была проведена ферментация с постоянной подпиткой дигидрофосфатом. В состав подпитки также были включены казаминовые кислоты, как легко доступный источник аминокислот, и дрожжевой экстракт. В ходе ферментации кривая скорости роста, показанная красным цветом, сначала вышла на плато, а затем плавно снижалась, никаких резких колебаний не наблюдалось. Кривая удельной скорости образования продукта имела аналогичный характер. Таким образом, с помощью подачи фосфатов можно управлять скоростью роста культуры и, следовательно, оптимизировать стадию биосинтеза.

Математическое моделирование. Поскольку производство многих белков в дрожжах определяется его стоимостью, крайне желательно иметь инструмент, позволяющий надежно и достаточно просто предсказывать и оптимизировать продуктивность, время процесса и титр продукта. Таким инструментом является математическое моделирование. Оно позволяет минимизировать временные и финансовые затраты на фармацевтическую разработку и производство продукта. Применяя методы вариационного исчисления, основанные на уравнениях Эйлера-Лагранжа и принципе максимума Понтрягина, можно решать различные оптимизационные задачи [Zhang, 2005].

В ряде работ зависимость удельной скорости образования qp от скорости роста описывается уравнением, подобным уравнению Моно [Maurer, 2006, Hensing, 1994]:

(1) = Для того, чтобы определить константы этого уравнения и построить зависимость в виде кривой мы исследовали диапазон скорости роста культуры 0,02-0,09 ч-1 в ряде ферментаций, одновременно определяя удельную скорость образования продукта.

Массив экспериментальных данных был обработан в программе Grapher и с помощью метода наименьших квадратов были вычислены константы уравнения qp= 5,2542 мг/(г АСВч) и kq=0,0382 ч-1.

Полученная по уравнению кривая зависимости удельной скорости образования белка от удельной скорости роста показана на рисунке 5.

Рис. 5. Зависимость удельной скорости образования белка E7(16)-HSP70 от скорости роста штаммаSCR-E7(16)-HSP70, полученная с помощью экспериментальных значений из процессов культивирования: 160514, 010814, 070814 Средняя ошибка аппроксимации при построении уравнения регрессии составила 11,9 %. Коэффициент детерминации – 0,72. Методом дисперсионного анализа по критерию Фишера было показано, что уравнение является статистически значимым.

Объемная продуктивность, которая является основным параметром оптимизации, определяется величиной удельной скорости роста и величиной удельной скорости образования продукта qP, которая, в свою очередь, также зависит от. Таким образом, параметр является основной переменной при оптимизации стадии биосинтеза.

Зависимость qP=f() соблюдается в рамках граничных условий, обусловленных особенностями роста штамма-продуцента и экспрессии целевого белка:

1) внесение глицерина в момент времени t0=0 (23 час культивирования);

2) неконтролируемое падение скорости роста и ее подъем до величины 0,08 ч-1с t0по t=3,5 час (рис. 4Б);

3) экспоненциальная стадия роста со скоростью 0,08 ч-1 с t=3,5 час по t=7,5 час и постепенное снижение скорости роста с t=7,5 часа (рис. 4Б);

4) неконтролируемое падение скорости роста и удельной скорости образования белка из-за токсического воздействия целевого белка на клетку при концентрации целевого белка более 15,5 мг/г АСВ.

Для решения оптимизационной задачи мы воспользовались методом вариационного исчисления.

Пусть X = X(t) – количество биомассы, P = P(t) количество продукта и = (t) – удельная скорость роста в момент времени t. Рост биомассы описывается уравнением ( ) = ( ) ( ),где начальное значение X(0) = X0. Выход продукта описывается уравгде qP – удельная скорость образования, которая и зависит от нением ()

–  –  –

2 = (5) 2 =+ (6) интеграл можно преобразовать следующим образом:

= + (7)

–  –  –

Рис. 7. Изменение удельной скорости роста штамма-продуцента SCR-E7(16)HSP70 в ходе биосинтеза белка E7(16)-HSP70 в процессах с оптимизированной подпиткой: µ - спрогнозированный профиль оптимальной скорости роста, 1- 010914, 2-070914, 3- 140914 Начиная с 36 часа, скорость роста падает быстрее, чем было спрогнозировано в модели и чем дальше, тем большее расхождение наблюдается между моделью и кривой роста, полученной в процессе культивирования. Такое снижение скорости роста связано с токсическим действием белка E7(16)-HSP70, хотя при экспрессии других гибридных белков такого эффекта не наблюдалось.

В таблице 4 приведены выходные параметры периодического процесса, процесса с внесением глицерина и процесса с подпиткой, рассчитанной в математической модели.

Объемная продуктивность в ферментации с подпиткой, рассчитанной математическим моделированием, в 1,86 раза больше, чем в ферментации с внесением глицерина и в 16,7 раз больше, чем в периодическом процессе.

–  –  –

Апробация подпитки в процессах культивирования 4-х штаммов SCR-E7-HSP70 При культивировании штаммов-продуцентов гибридных белков E7-HSP70 6,11 и 18 типов была использована та же математическая модель. При этом мы приняли, что qpmax и Yxs для этих штаммов равны значениям qpmax и Yxs, экспериментально полученным для штамма SCR-E7(16)-HSP70; в процессе культивирования использовался профиль подпитки, рассчитанный для штамма SCR-E7(16)-HSP70.

На рисунке 8 показано накопление целевого белка в ходе культивирования с оптимизированной подпиткой. Продуцент белка E7-HSP70 18 типа показал максимальный титр по продукту среди всех четырех штаммов.

–  –  –

Рис. 8. Накопление белков E7(16)-HSP70, E7(18)-HSP70, E7(11)-HSP70 и E7(6)HSP70 при культивировании 4-х штаммов-продуцентов в процессах с оптимизированной подпиткой: P – прогноз накопления продукта, 1– E7(6)-HSP70, 2 – E7(11)-HSP70, 3 – E7(16)-HSP70, 4 – E7(18)-HSP70 В таблице 5 показаны выходные параметры процессов культивирования штаммов SCR-E7-HSP70 при апробации оптимизированной подпитки. Оптимизация подпитки значительно повлияла на объемную производительность и титр целевого продукта.

–  –  –

Конечный титр целевых белков E7(6)-HSP70 и E7(11)-HSP70 составил 1600,3 ± 165,6мг и 1680,5 ± 170,1мг с литра соответственно, а для белков E7(16)-HSP70 и E7(18)-HSP70 – 740,2 ± 75,4мг и 2770,6 ± 260,2 мг с литра.

Для штамма SCR-E7(16)-HSP70 объемная продуктивность возросла в 16,7 раз, конечный титр в – 13,9 раз. Для штаммов SCR-E7(11)-HSP70 и SCR-E7(6)-HSP70 – объемная производительность возросла в 10,6 и 10,2 раза, а титр конечного продукта в 8,4 и 8,0 раз, соответственно. Объемная производительность штамма SCR-E7(18)-HSP70 возросла в 9,4 раза, а титр конечного продукта в 7,6 раз.

На рисунке 9 приведена универсальная технологическая схема этапа культивирования четырех штаммов-продуцентов SCR-E7-HSP70 в процессе производства вакцин.

Рис. 9. Технологическая схема производства терапевтических вакцин – этап культивирования штамма-продуцента Разработка способа дезинтеграции После проведения процесса культивирования необходимо выделить и осветлить белок для последующей очистки.

Нами был разработан процесс дезинтеграции, заключающийся в последовательном пропускании суспензии клеточной биомассы через гомогенизатор, оснащенный охлаждающим теплообменником. В ходе работы было исследовано влияние давления в камере разрушения гомогенизатора и количества циклов дезинтеграции на выход общего клеточного белка и целевого продукта (рис.10). Показано, что использование давления значением в 950 Бар в ходе дезинтеграции позволяет в два раза интенсифицировать процесс по сравнению с разрушением при 600 Бар. Охлаждение клеточной суспензии между циклами дезинтеграции и использование ингибиторов протеаз и восстанавливающего агента в составе буфера позволило получить стабильный продукт с низкой степенью агрегации.

Разработанный способ дезинтеграции был масштабирован в 8 раз и апробирован в ходе разрушения биомассы 4 штаммов-продуцентов.

–  –  –

Рис. 10. Влияние давления на эффективность дезинтеграции биомассы штамма-продуцента SCR-Е7(16)-HSP70 В табл. 6 приведены параметры разработанного способа разрушения, состав лизирующего буфера и средний выход продукта с 1 г биомассы.

–  –  –

Средний выход продукта с 1 г биомассы составил 6,2 ± 0,5 мг, 16,8 ± 1,0 мг, 16,4 ± 1,0 мг и 16,0 ± 1,0 мг для гибридных белков E7(16)-HSP70, E7(18)-HSP70, E7(6)-HSP70 и E7(11)-HSP70 соответственно.

Очистка субстанции гибридных рекомбинантных белков После разрушения биомассы продуцента полученный клеточный лизат каждого из гибридных белков осветляли путем центрифугирования на проточной центрифуге (Thermo, Германия) и фильтрации с помощью фильтра Sartopore 2 диаметром пор 0,22 мкм. Полученный раствор гибридного белка подвергали 4-х стадийной очистке: металл-хелат аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии, стадии концентрирования и гель-фильтрационной хроматографии.

В табл. 7 показана достигнутая после всех стадий очистки средняя финальная продуктивность с 1 л культуральной жидкости: 180,0 ± 17,5 мг белка Е7(16)-HSP70, 692,4 ± 72,1 мг белка Е7(18)-HSP70/ л, 425,1 ± 35,3 мг белка Е7(11)-HSP70/ л, 395,0 ± 43,2 мг белка Е7(6)-HSP70/ л. Потери в ходе очистки составили 75 %.

Таблица 7. Выход гибридных белков до и после проведения очистки

–  –  –

Сорбция антигенов на адъювант осуществлялась в реакторе. Содержание гидроксида алюминия в вакцине составляло 0,8 мг/мл. В зависимости от вида вакцины концентрация антигенов Е7(6)-HSP70, Е7(11)-HSP70 составляла 0,2 мг/мл и 0,2 мг/мл, антигенов Е7(16)-HSP70, Е7(18)-HSP70 - 0,4 мг/мл и 0,4 мг/мл соответственно. Затем производился розлив готовой вакцинной массы по бутылям.

Полученные серии вакцины против рецидивирующего респираторного папилломатоза, аногенитального кондиломатоза и вакцины против рака шейки матки оценивали по параметрам ФСП и направляли в доклинические исследования.

На рис. 11 приведена универсальная технологическая схема на этапах дезинтеграции, биохимической очистки субстанции гибридных рекомбинантных белков и изготовления ГЛФ в процессе производства двух терапевтических вакцин.

Рис. 11. Технологическая схема производства терапевтических вакцин – этап выделения, этап биохимической очистки и этап изготовления ГЛФ вакцин

ВЫВОДЫ

1. Разработан универсальный способ двухстадийного культивирования, состоящий из этапов накопления биомассы и биосинтеза целевого белка, для каждого из которых определены оптимальные условия культивирования, в том числе режимы внесения питательного субстрата. Способ культивирования позволяет с использованием оптимизированного профиля расхода подпитки лимитирующим компонентом позволяет достичь продуктивности 740,2 ± 75,4 мг/л, 2770,6 ± 260,2 мг/л, 1600,3 ± 165,6 мг/л и 1680,5 ± 170,1 мг/л по гибридным белкам E7(16)-HSP70, E7(18)-HSP70, E7(6)-HSP70 и E7(11)-HSP70, соответственно.

2. Математическая модель стадии биосинтеза целевого белка E7(16)-HSP70 путем оптимизации профиля расхода подпитки лимитирующим компонентом позволила увеличить объемную продуктивность полунепрерывных процессов культивирования штаммов-продуцентов SCR-E7(16)-HSP70, SCR-E7(18)-HSP70, SCR-E7(11)-HSP70 и SCR-E7(6)-HSP70, соответственно, в 16,7 раз, в 9,4 раз, в 10,6 раза и в 10,2 раза по сравнению с периодическим процессом.

3. Разработанный способ дезинтеграции клеток штаммов-продуцентов путем 7кратного пропускания клеточной суспензии через гомогенизатор APV 1000 при давлении 950 бар обеспечивает стабильность целевого продукта и выделение из 1 г биомассы гибридных белков E7(16)-HSP70, E7(18)-HSP70, E7(6)-HSP70 и E7(11)-HSP70 в количестве 6,2 ± 0,5 мг, 16,8 ± 1,0 мг, 16,4 ± 1,0 мг 16,0 ± 1,0 мг соответственно.

4. Разработанная технология, включающая способы культивирования, дезинтеграции и биохимической очистки целевых белков E7(16)-HSP70, E7(18)-HSP70, E7(11)HSP70 и E7(6)-HSP70 обеспечивает получение фармацевтических субстанций продуктов, соответствующих требованиям спецификации нормативного документа, в количестве 180,0 ± 17,5 мг, 692,4 ± 72,1 мг, 425,1 ± 35,3 мг, 395,0 ± 43,2 мг очищенного белка с 1 л культуральной жидкости, соответственно.

5. На основе полученных субстанций произведены опытные серии готовых лекарственных форм двух терапевтических вакцин против рецидивирующего респираторного папилломатоза, аногенитального кондиломатоза и против рака шейки матки, прошедшие контроль качества согласно ФСП.

6. Разработана документация для включения в регистрационное досье вакцин против ВПЧ - ассоциированных с заболеваний, в том числе опытно-промышленные регламенты.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Штаммы-продуценты гибридных белков E7(6)-HSP70, E7(11)-HSP70, E7(16)HSP70, E7(18)-HSP70 были депонированы в ВКПМ (Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов) под номерами Y-3919, Y-3853, Y-4057, Y-4058 соответственно.

2. Разработанная технология использована в производстве ГЛФ вакцин для проведения доклинических испытаний и исследований стабильности в рамках государственных контрактов № 16.N08.12.1024 и № 13411.1008799.13.173 от Минобрнауки и Минпромторга России.

3. Разработаны и утверждены опытно-промышленные регламенты на производство вакцин, содержащие схемы и описание производственных процессов под № 00479942и № 00479942-01-15.

<

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Рекомендовать использовать созданную математическую модель для оптимизации стадии биосинтеза новых штаммов-продуцентов, созданных на основе штаммареципиента S. cerevisiae D702.

2. На основании данных, полученных в ходе проведения доклинических исследований по параметрам острой и хронической токсичности, специфической токсичности (репродуктивности, генотоксичности, мутагенности) рекомендовать использовать терапевтическую вакцину против рецидивирующего респираторного папилломатоза, аногенитального кондиломатоза и терапевтическую вакцину против рака шейки матки для проведения клинических испытаний.

3. Обоснованные научные подходы по разработке технологии производства субстанций терапевтических вакцин против рецидивирующего респираторного папилломатоза, аногенитального кондиломатоза и рака шейки матки могут быть использованы при создании ветеринарных терапевтических вакцин.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Леонов, В.С. Разработка промышленного способа культивирования штаммовпродуцентов гибридных рекомбинантных белков E7 вируса папилломатоза человека 6 и 11 типов и белка теплового шока HSP 70 / В.С. Леонов, Н.А. Литвинова, Е.В. Горожанина // Биофармацевтический журнал – 2014. – Т. 6. – №1. – С. 12-16.

2. Леонов, В.С. Разработка промышленного способа дезинтеграции биомассы штаммов-продуцентов гибридных рекомбинантных белков E7 вируса папилломатоза человека 16 и 18 типов и белка теплового шока HSP 70 / В.С. Леонов, Е.В. Горожанина, С.А. Черепушкин // Биофармацевтический журнал – 2014. – Т. 6. – №6. – С. 10-16.

3. Леонов, В.С. Оптимизация биосинтеза гибридных рекомбинантных белков E7 вируса папилломатоза человека 6, 11, 16 и 18 типов и белка теплового шока HSP 70 методом математического моделирования / В.С. Леонов, И.Р. Яхин, Н.В.Стратонова // Биофармацевтический журнал – 2015. – Т. 7. – № 1. – С. 13-17.




Похожие работы:

«РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова Факультет почвоведения УТВЕРЖДАЮ Программа учебной практики Учение об атмосфере Направление подготовки №022000 Экология и природопользование Профиль подготовки Экологи...»

«УДК 338.14 Вусов Александр Владимирович Vusov Alexandr Vladimirovich аспирант Московской финансово-промышленной PhD student, Moscow University академии МФПУ "Синергия", for Industry and Finance Synergy руководитель проектов, Project manager, Консалтинговая группа "Апхилл" Consulting Group “Uphill” dom-hors@mail.ru dom-hors@mail.ru МЕ...»

«ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 3 2012 СЕРЫЯ БІЯЛАГІЧНЫХ НАВУК УДК 579.22:582.28:66.081 В. В. ЩЕРБА, Т. А. ПУЧКОВА, Л. Т. МИШИН ОБРАЗОВАНИЕ СОЕДИНЕНИЙ ИНДОЛЬНОЙ ПРИРОДЫ СЪЕДОБНЫМИ И ЛЕКАРСТВЕННЫМИ ГРИБАМИ Институт мик...»

«УДК 639.371.5 ДИНАМИКА РЫБОВОДНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ШЕСТИ ПОКОЛЕНИЙ БЕЛОВСКОГО КАРПА КАК РЕЗУЛЬТАТ СТУПЕНЧАТОГО ОТБОРА ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ Законнова Л.И., Ростовцев А.А. Филиал КузГТУ в г. Белово Белово, Россия (652644, Кемеровская обл., г. Белово, пгт....»

«ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА Рабочая программа по обществознанию 8 класса составлена на основании документов: 1.Федеральный закон "Об образовании в Российской Федерации" от 29.12.201.2 №273 2.Приказы Министерства образовани...»

«EBRD Classification: INTERNAL Субпроект по обращению с твердыми отходами в Нуреке Таджикистан Страна: Номер проекта: 46409 Муниципальная и экологическая Отраслевой сектор: инфраструктура Государственный/частный сектор: Государственный сектор Экологическ...»

«Российская академия Наук уРальское отделеНие иНститут экологии РастеНий и животНых СОВЕТЫ МОЛОДОМУ УЧЕНОМУ методическое пособие для студентов, аспирантов, младших научных сотрудников и, может быть, не толь...»

«РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ (19) (11) (13) RU 2 577 068 C1 (51) МПК A23B 4/06 (2006.01) ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ (12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ 2014148815/13, 03.12.2014 (21)(22) Заявка: (72...»

«Рамочный механизм по обращению с твердыми отходами в Таджикистане Таджикистан Страна: Номер проекта: 46197 Муниципальная и экологическая Отраслевой сектор: инфраструктура Государственный/частный сектор: Государственный сектор Экологическая категория: Дата прохождения Совета 26 ноября 2014 года директоров Прошел стадию рассмотрения...»

«Научно – исследовательская работа ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА ШОКОЛАДА И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА ОРГАНИЗМ Выполнил: Бегоулев Даниил Олегович учащийся 9 класса МОУ "Средней общеобразовательной школ...»










 
2017 www.book.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.