WWW.BOOK.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные ресурсы
 
s

«АУТОАНТИТЕЛА К НУКЛЕИНОВЫМ КИСЛОТАМ ПРИ ИММУНОКОНФЛИКТНОЙ БЕРЕМЕННОСТИ ...»

0^734614

На правах рукописи

Зайнуллин Алмаз Анасович

АУТОАНТИТЕЛА К НУКЛЕИНОВЫМ КИСЛОТАМ

ПРИ ИММУНОКОНФЛИКТНОЙ БЕРЕМЕННОСТИ

03.00.04 -биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань - 2003

^

Работа выполнена на кафедре биохимии Казанского государственного

университета и лаборатории генной диагностики Татарского научноисследовательского института сельского хозяйства Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Винтер В.Г.

кандидат медицинских наук, Абдрахманова Л.Р.

Официальные оппоненты: академик АН РТ, доктор медицинских наук профессор Зубаиров Д.М.

доктор биологических наук, Чернова О.А.

Ведущая организация: Казанская государственная Медицинская Академия, г. Казань

Защита диссертации состоится 2003 г. в '1_^_~?ч- на заседании диссертационного Совета Д.212.081.08 при Казанском государственном университете им. В.И.

Ульянова-Ленина, по адресу:

420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного университета Автореферат разослан 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета Кандидат биологических наук

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время наблюдается рост рождения детей с гемолитической болезнью новорожденных (ГБН), поэтому уменьшение риска Rh-аллоиммунизации у резусотрицательных (Rh(-)) матерей, а также своевременная диагностика, оценка степени тяжести и лечение этого заболевания представляют важную проблему для здравоохранения. По данным доклада Минздрава России в г. Курске на II Российском съезде медицинских генетиков (2000 г.) ГБН в России занимает III место среди заболеваний после врожденных пороков развития и респираторных нарушений у новорожденных. Анализ динамики заболевания среди недоношенных новорожденных в родильном отделении РКБ республики Татарстан показал, что с 1994 г. ГБН увеличилась с 2,9% до 8,33% и занимает II-III место после внутричерепных родовых травм (61,67%), внутриматочной гипоксии и асфиксии (8,33%) (Рыбкина, 1999).

Одной из основных причин данного заболевания является резусаллоиммунизация - тяжелая патология перинатального и постнатального периода, приводящая к мертворождению, ранней детской смертности и инвалидизации детей в виду отсутствия массовой профилактики анти-резусным иммуноглобулином после родов и абортов у Rh(-) беременных. Скрининговые программы по пренатальной диагностике резус-аллоиммунизации у Rh(-) беременных существуют во многих странах и включают как неинвазивные, так и инвазивные методы диагностики. К неинвазивным методам диагностики относятся - определение резусантител (Rh-AT) изосерологическими методами у всех Rh(-) беременных, ультразвуковое исследование плода и плаценты (Абдрахманова и др., 2000; Branch, 1998; Huang, 1996). Инвазивные методы диагностики предполагают: амниоцентез с целью определения билирубина (Bi) околоплодных вод спектрофотометрическим методом (Moise, 1994) и диагностики Rh-принадлежности плода по амниоцитам с применением метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Furundarena et al., 1999; Iskaros et al., 1998; Rahman et al., 1998).





В ряде случаев применяется кордоцентез с целью определения гемоглобина, Bi, группы и Rh-принадлежности крови плода и степени тяжести гемолитической болезни плода (ГБП) (Михайлов, 1996).

В последнее время при диагностике репродуктивной патологии стали применять аутоиммунные маркеры - аутоантитела (ААТ) к хорионическому гонадотропину человека, фосфолипидам, нативной и денатурированной ДНК (нДНК и дДНК) (Тимохина и др., 2002;

Шляхтенко и др., 2002). Практически неизученной является роль ААТ к нуклеиновым кислотам (НК) при иммуноконфликтной беременности - резус- и АВО- аллоиммунизации.

Целью настоящей работы явилось исследование \ровня ЛАТ к НК в сыворотке крови при нммуноконфликтной беременности.

Были поставлены следующие задачи:

1. Определить пороговые уровни (X±2а и J V ± ? C T ) содержания ААТ к НК в сыворотке крови здоровых доноров для определения границ нормы и патологии.

2. Изучить содержание ААТ к НК в сыворотке крови беременных женщин и их детей при различных формах ГБП.

3. Исследовать влияние АВО-аллоиммунизации на \ровень содержания ААТ к НК в сыворотке крови рожениц.

4. Разработать комплексный подход для диагностики различных форм ГБП с применением ИФА на ААТ к НК в сыворотке крови, а также Rh- и АВО- генотипирование плода методом ПЦР.

Научная новизна. Впервые проведены исследования методом ИФА по содержанию А А Т к РНК, нДНК и дДНК в сыворотке крови \ беременных и женщин, родивших детей с гемолитической болезнью (ГБ) по Rh - и АВО- системе.

Была выявлена прямая зависимость между уровнем ААТ к РНК и тяжестью заболевания при внутриутробной форме ГБП.

Установлено, что изменение уровня ААТ к РНК в сыворотке крови беременных женщин может служить показателем состояния фетоплацентарного барьера и являться значимым диагностическим критерием при внутриутробных и анемической формах ГБП.

Практическая значимость. Установленные пороговые уровни содержания ААТ к НК в сыворотке крови здоровых доноров могут быть использованы для определения границ нормы и патологического состояния.

Наличие повышенного уровня ААТ к РНК характерное при внутриутробной и анемичной форме ГБП может использоваться как критерий для оценки тяжести заболевания при иммуноконфликтной беременности.

Применение метода ПЦР и ПДРФ на определение Rh- и АВОпринадлежностп плода способствует точной диагностике ГБП.

Использованные методы диагностики ААТ к НК в сыворотке крови имм)неконфликтных беременных женщин и определение Rh- и АВО-принадлежности плода методом ПЦР и ПДРФ были апробированы при обследовании беременных женщин в условиях межрегионального медико-генетического центра РКБ РТ.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены в докладах на I l ( I Y ) российском съезде м е д и ц и н с к и х г е н е т и к о в (Курск. 2000). на юбилейной конференции КНИИЭМ (Казань. 2000).

на Y1 всероссийской н а \ ч н о й конференции Молекулярные основы и м м \ н о р е г \ л я ш ш. и м м у н о д и а г н о с т и к и и и м м у н о т е р а п и и (Санкт- Петербург.2002). на республиканской к о н ф е р е н ц и и ••Резуск о н ф л и к т н а я беременность» ( K a з a н ь. 2002.). нa II м с ж д у н а р о д н о й конференции «(Experimental and C l i n i c a l Reproductive I m m u n o b i o l o g »

(Amsterdam, 2000).

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 8 опубликованных работах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения п о л у ч е н н ы х результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 136 страницах, содержит 14 таблиц и 10 рисунков. Список литераторы включает 226 наименований, из которых 54 отечественных и 172 иностранных работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Беременные женщины, их дети и здоровые доноры. В работе анализировали сыворотку крови 57 беременных женщин, проходящих обследование в медико-генетическом центре РКБ, 69 рожениц и 67 новорожденных детей с резус-аллоиммунизацией из родильного отделения РКБ г. Казани. Анализировали сыворотки крови 250 здоровых людей в возрасте от 16 до 60 лет без клинических симптомов аутоиммунных заболеваний из донорских пунктов КНИИЭМ и РКБ.

Амниотическая жидкость (АЖ) забиралась под ультразвуковым контролем в условиях стационара РКБ у беременных женщин с высоким риском ГБП на 20-37 неделях беременности.

Определение резус-принадлежности плода методом ПЦР проводилась по методике, предложенная Bennett с соавторами (Bennet et al., 1993), с нашими изменениями, Праймеры А1 и А2 специфично амплифицируют 136 нуклеотидный фрагмент ДНК RhCcEe и RhD генов (7 экзон).

Вторая пара праймеров, A3 и А4, амплифицирует 186 нуклетидный фрагмент ДНК RhD гена (10 экзон). Для RhD(+) генотипа характерно наличие 136 и 186 нуклеотидных продуктов (н.п.) амплификации, для RhD(-) только 136 н.п. ДНК выделяли из цельной крови из амниоцитов плода. Объем амплификационной смеси составлял 50 мкл, которая содержала 1-2 мкл человеческой геномной ДНК, по 20 рМ каждого из четырех праймеров, 10 мМ Трис-НС1 буфер (рН 8,3), 1,5 мМ MgCb, 50 мМ КС1, 0,1% TritonX-100, 200 мкМ NTP, 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы.

ПЦР проводили на термоциклере «Терцик» («ДНК-Технология», Москва): предварительная денатурация - 2 мин при 94°С; затем 30 циклов денатурации - 1мин при 94°С, отжига праймеров - 1 мин при 56°С, элонгации ДНК - 1 мин при 72°С; конечная элонгация - 8 мин при 72°С.

Продукты амплификации разделялись при помощи электрофореза в 3% агарозном геле, содержащем 0,5 мг/мл этидиум бромида, в 0,01 М ТБЕ-буфере, рН 8,3, при 150 В в течение 1 ч. Для оценки размеров полученных фрагментов ДНК использовался стандартный маркер длиной 100-1000 н.п. («Сибэнзим», Новосибирск). Результат визуализировали в УФ-свете при Х=3 10 нм.

Определение АВО-групп крови методом ПЦР и полиморфизма рестрикционных фрагментов (ГШР-ПДРФ) делали согласно методике, опубликованной Tun с соавторами (Tun et al., 1996). ДНК выделяли из цельной крови из амниоцитов плода. Проводили амплификацию 2 локусов АВО-гена: праймеры АВО1+АВО2 амплифицировали фрагмент размером 200 н.п., праймеры АВОЗ+АВО4 амплифицировали фрагмент размером 128 н.п. гена А-трансферазы.

Амплификация проходила в смесях в тех же объемах и при таких же условиях, как и при определении резус-принадлежности.

Затем 10 мкл пробы после ПЦР (содержащую фрагменты ДНК 200 и 128 н.п.) инкубировали с рестриказами Alul и Крп!

(«Сибэнзим», Новосибирск), по 5 ед. каждой, при 37°С в течение 1,5 ч.

ДНК-фрагменты после рестрикции разделяли электрофорезом в 10% полиакриламидном геле, в 0,01 М ТБЕ-буфере, рН 8,3, при 500 В в течение 1 ч. После электрофореза проводилось окрашивание геля раствором этидия бромида (1мг/мл) в 0,01 М ТБЕ-буфере, рН 8,3, в течение 20 мин и визуализация в УФ-свете при Х=310 нм. Для оценки размеров полученных фрагментов ДНК использовался стандартный маркер длиной 100-1000 н.п. («Сибэнзим», Новосибирск).

ААТ к НК в сыворотке крови определяли методом ИФА на полистироловых планшетах НПО «Полимед», г. С.Петербург (Саттарова и др., 1994; Зайнуллина и др., 2000). Для сравнения воспроизводимости результатов в качестве стандарта использовали пул сывороток крови здоровых доноров с низким уровнем ААТ к НК. Полученные данные выражали в относительных единицах (отн.

ед.), вычисленных по формуле:

ОП450-630 исследуемой сыворотки отн. ед.= ОП45о-бЗО стандарта Измерения ОП проводили на приборе Opsys MR («Dynex», США) при длинах волны 450 и 630 нм.

В качестве РНК-антигена (АГ) использовали суммарную дрожжевую РНК (НПО «Вектор», г. Новосибирск). В качестве нДНКАГ использовали коммерческий препарат ДНК (НПО «Вектор», г.

Новосибирск). дДНК готовили прогреванием раствора ДНК (50 мкг/мл) с добавлением 0,05% формальдегида в течение 15 мин при 100°С с последующим быстрым охлаждением на ледяной бане.

Определение Rh-AT серологическим методом проводили по методике

- непрямой реакции Кумбса (Меньшиков, 1987). Уровень содержания AT выражали в титрах.

Спектрофотометрическое определение Bi у новорожденных проводили по унифицированному методу по диазореакции в присутствии акселератора (метод Ендрасика - Клеггорна - I рофа).

Концентрацию Bi а сыворотке крови выражали в мкмоль/л (Меньшиков, 1987).

Статистическая обработка полученных ре!ульгатов выполнялась на персональном компьютере: Windows 98; Microsoft Excel 2000 (пакет статистических программ).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Обнаружение ААТ к НК в сыворотке крови у здоровы людей Результаты наших исследований показали, что уровень содержания ААТ к НК варьирует в широких пределах - от 0,1 до 2,3 отн. ед.

Числовые показатели содержания ААТ соответствовали закону нормального распределения, поэтому при вычислении границ содержания ААТ в норме использовали формулы, принятые для этого вида распределения. Были вычислены средние (х„), стандартная ошибка (т), стандартное отклонение (а). Данные анализа частоты встречаемости индивидуальных уровней содержания АА'Г к РНК в сыворотке крови среди обследованных лиц представлены на рисунке

1. У большинства (61%) здоровых людей уровень содержания ААТ к РНК находится в диапазоне 0,71 - 1,3 отн. ед., у 25% людей обнаруживается значительно более низкое (0,1-0.7 отн.ед.) и у 14% высокое (1,31-2,3 отн.ед.) содержание ААТ к РНК. Средний уровень содержания ААТ к РНК в сыворотке крови здоровых людей составил 0,95±0,01 отн.ед., а=0,25 отн.ед. Для разграничения нормы от патологии, мы вычислили пороговые уровни ААТ к РНК в норме, которые составили: для ха±2о - 0,95±0,50 отн.ед. (р0,05) и для х„±3а

-0,95±0,75 отн.ед. (р0,01).

Уровень содержания ААТ к нДНК в сыворотке крови здоровых доноров находился в пределах 0,53-2,20 отн.ед. Средний уровень ААТ к нДНК составил 1,00±0,02 отн.ед., а - 0,20 отн. ед., пороговый уровень нормы - 1,00±0,40 отн.ед. (х„±2а) и 1,00±0,60 отн.ед. (хв±3а).

У 49% обследованных доноров уровень содержания ААТ к нДНК находится в диапазоне 0,7-1,1 отн.ед. Низкий уровень содержания антител (0,51-0,7 отн.ед.) обнаружен у 13% людей, а высокий уровень содержания ААТ к нДНК (1,1-2,2) у 35% здоровых доноров (рис.1.).

По распределению индивидуальных уровней содержания ААТ к дДНК складывается похожая картина. Средний уровень составил 1,12±0,02 отн.ед., о - 0,2 отн.ед. Значения варьируют от 0,5 до 2 отн.

ед. Пороговый уровень ААТ к дДНК в норме составил 1,12±0,40 отн.ед. (хв±2ст) и 1,12±0,60 отн.ед. (х„±3а). 46% доноров имеют диапазон значений уровней содержания ААТ от 0,71 до 1,1; 10% от 0,5 до 0,7 и 42% от 1,11 до 2 отн. ед. (рис.1.). Числовые данные содержания ААТ к дДНК и нДНК соответствовали закону нормального распределения.

–  –  –

возрастных г р \ п п (табл.1), но отличий от генеральной чжоклпности не было обнаружено ни в одной возрастной группе. Так же не обнаружено достоверных отличий при сравнении доноров, различающихся по группам крови и Rh-факгору (габл.2).

–  –  –

Нами была обследована группа здоровых беременных женщин, совместимых с мужьями по группам крови. У здоровых беременных женщин на момент родов уровень аутоантител к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови достоверногне отличался от показателей здоровых доноров и составил (в отн. ед.): к РНК - 1,07±0,10; к нДНК к дДНК - 0,98±0,14. Эта обследованная группа рожениц была использована в качестве контроля при исследовании беременных женщин с различными формами резус- и АВОаллоиммунизации (табл.3).

Обнаружение ААТ к НК в сыворотке иммуноконфликтных беременных женщин и их новорожденных детей. У беременных женщин, родивших детей с внутриутробной (ВФ) и анемической формой (АФ) ГБП наблюдается достоверное (р0,05) повышение уровня ААТ к РНК по сравнению с контрольной группой. Наиболее высокий уровень ААТ к РНК при Rh-конфликтной беременности был обнаружен в группе беременных с ВФ ГБП тяжелой степени отн.ед. (р0,01) по сравнению с контролем (табл.3). При ВФ ГБП средней степени тяжести уровень ААТ к РНК в сыворотке крови беременных женщин составил 1,86±0,39 отн.ед. (р0,05) по

–  –  –

сравнению с контрольной группой (табл.3). При этом уровень ААТ к РНК в группах с послеродовой формой (ПФ) ГБН не имело достоверных отличий от уровня контроля независимо от степени тяжести заболевания. При сравнении общих групп беременных женщин с ВФ и ПФ ГБ были выявлены статистически достоверные различия (р0,01) в уровне ААТ к РНК в сыворотке крови (2,07±0,22 и 1,34±0,12 отн.ед. соответственно). Было отмечено достоверное повышение уровня ААТ к РНК в сыворотке крови в группе беременных с анемической формой ГБП 1,56±0,18 отн.ед. (р0,05) по сравнению с.контролем (табл.3). Уровень содержания ААТ к нДНК и II

–  –  –

Выявлено влияние АВО-несовместимости на уровень ААТ к РНК в сыворотке крови беременных. АВО-несовместимость у Rhконфликтных беременных приводила к дополнительному увеличению уровня ААТ к РНК (табл.4). Но наиболее высокое содержание ААТ к РНК наблюдался у беременных, родивших детей с ГБН по АВО

–  –  –

Вероятно, повышение уровня ААТ к РНК не связано с предшествующей иммунизацией и, является, скорее всего, результатом проникновения РНК-АГ плода через плаценту и выработкой ААТ к РНК у матери во время текущей беременности.

Это предположение подтверждается обнаружением повышенного уровня ААТ к РНК у женщин со 2-й половины беременности с различными формами ГБП.

Содержание ААТ ко всем трем антинуклеарным АГ в сыворотке крови беременных, имевших в крови Rh-AT и родивших детей без ГБН, не превышало верхнего предела порогового уровня, в некоторых случаях было обнаружено даже достоверное снижение уровня ААТ к нДНК и дДНК у Rh(-) беременных без Rh-AT, родивших детей без ГБН (0,56±0,06 и 0,63±0,09 отн.ед. соответственно) и ААТ к нДНК у Rh(+) беременных несовместимых с мужьями по группам крови (0,61+0,03 отн.ед.) по сравнению к контрольной группе (табл.6).

–  –  –

При исследовании зависимости титра Rh-AT, определяемых серологическим методом и уровня ААТ к РНК и ДНК, выявляемых методом ИФА, была обнаружена тенденция к повышению уровня ААТ к РНК с повышением титра Rh-AT до 1:32 (табл.7). Однако при проведении корреляционного анализа индивидуальных сывороток крови с помощью программы Microsoft Excel 2000 не было обнаружено высокой степени корреляции между уровнем содержания ААТ к РНК и титром Rh-AT.

Определение резус-статуса плода с помощью ПЦР. Для определения Rh-принадлежности пациентов использовали ПЦР на два локуса: 10 экзон RhD гена и 7 экзон RhCcEe и RhD генов. Продуктом амлификации 7 экзона с праймерами А1 и А2 был фрагмент ДНК размером 136 н.п., 10 экзона с праймерами A3 и А4 — 186 н.п.

Фрагмент 136 н.п. служит внутренним контролем на эффективность проведения ПЦР. Фрагмент размером 186 н.п. маркером Rhпринадлежности пациента. Наличие после ПЦР фрагментов размером 136 и 186 н.п. характерно для Rh(+) людей, у Rh(-) индивидов наблюдается только фрагмент размером 136 н.п.

Всего было проведено 27 исследований крови доноров на Rhпринадлежность. Из них 13 человек оказалось Rh(+), 14 - Rh(-).

Результаты ПЦР-тестирования на Rh-принадлежность совпали с данными серологического анализа в 100% случаев.

После проведенных предварительных исследований, с целью пренатальной диагностики проводили амниоцентез у Rh(-) беременных с Rh-аллоиммунизацией и высоким риском ГБП на сроке 20-37 недель. Для определения Rh-принадлежности плода методом ПЦР использовали ДНК амниоцитов. Параллельно определяли Bi в АЖ спектрофотометрическим методом. Rh-принадлежность новорожденного подтверждали после родов серологическим методом.

–  –  –

Рис. 2. ПЦР на RhD и RhCcEe локусы.

Дорожки: М - маркер (100-1000 н.п.); 1 - К(-); 2 - амниоциты плода (Rh(+)); 3 - кровь матери (Rh(-)); 4 - кровь отца (Rh(+)).

На рис. 2 представлены данные ПЦР на RhD и RhCcEe локусы.

Как видно из рис. 2, у плода (дорожка 2) и отца (дорожка 4) после амплификации присутствуют фрагменты ДНК размером 136 и 186 н.п.

У матери (дорожка 3) имеется продукт амплификации только 136 н.п.

Таким образом, отец и плод имеют RhD(+) принадлежность, мать RhD(-). В данном случае возможен Rh-конфликт между матерью и плодом. В зависимости от уровня ААТ к РНК можно диагностировать возникновение ВФ или ПФ ГБП. По данным серологического анализа проведенного до ПЦР у отца была Rh(+), а у матери Rh(-) группа крови. Резус-статус плода, определенный пренатально методом ПЦР, был подтвержден серологическим методом после рождения ребенка.

Было исследовано 25 АЖ. У 16 п ю юв было определено н а л и ч и е 7 и 10 жзонов, v 9 - готько "" ж зон Уровень Bi в \Ж был повышен у 2 Rh(+) плодов и I Rh(-) плода, у 2 Rh(-) и 5 Rh(-) плодов уровень Bi в АЖ находился s границах нормы. Данные молекулярной диагностики в 100% совпадали с постнагальными серологическими исследованиями.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой корреляции между результатами ПЦР-анализа и серологическими методами В некоторых случаях наблюдается повышение уровня Bi в АЖ и при Rh(-) плоде. Использование ПЦР на 7 и 10 экзоны позволяет избежать подобные ложноположительные результаты, а также диагностировать ПФ ГБН при нормальном уровне Bi в АЖ при Rh(J-) плоде.

Комплексное определение уровня Bi спектрофотометрическим методом и Rh-принадлежности плода методом ПЦР при амниоцентезе может способствовать точной диагностике Rh-статуса плода, в выборе тактики лечения при высоком риске ГБП и оптимальных сроков родоразрешения.

Определение ABQ-групп крови методом ПЦР и полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ) Проводили амплификацию двух АВО-локусов: праймеры АВО1+АВО2 амплифицировали фрагмент размером 200 н.п., праймеры АВОЗ+АВО4 амплифицировали фрагмент размером 128 н п гена А-трансферазы).

5 М 4 3 2 1 Рисунок 3. ПЦР-ПДРФ на АВО-принадлежность.

Дорожки: 1 - ОО(1); 2 - АА(Н); 3 - ВО(Ш); 4 - AB(IV); 5 - АА(П); \1 маркер (100-1000 н.п.) Затем 10 мкл пробы после ПЦР (содержащую фрагменты ДНК 200 и 128 н.п.) инкубировали с рестриказами Alul и Kpnl аспределение фрагментов ДНК посте рестрикции показано на ис\нне 3 На дорожках 1-5 расположены пробы крови доноров с

-лппой ОО(1). 4А(Ш BO(im AB(IV) и АА(11) соответственно М аркер (100-1000 нп ) Методом ПЦР-ПДРФ было исследовано 20 проб крови емейных пар (м\ж-жена) По результатам анализа 8 человек имели енотип ОО(1), 2- АА(П), 5 - АО(П), 4 - ВО(Ш), 1 -АВ(1\) Данные овпали в 100° о случаев с серологическими анализами Точное установление генотипа родителей по АВО-гр^ппам крови озволило, исходя из менделевского закона распределения гамет прогнозировать все возможные варианты гр^пп крови детей \ этих емейных пар что было достаточно важно для подбора донорской рови для переливания новорожденном;, при высоком риске сложнений при родах Было также обследовано совместно с \ЕОипированием отца и матери, 3 пробы АЖ на АВО-принадпежность пода 2 плода имели генотип ОО(1), 1 плод - генотип AO(II) ABOтринадлежность крови \ детей была подтверждена постнатально во scex с л \ ч а я х серологическим методом

–  –  –

Рис 4 ПЦР-ПДРФ на ^ВО принадлежность Дорожки М - маркер 1100-1000 н п ) 1 - К(-) 2 - амниош-чь плода ( O C M i ) ^ - к р ш ь Maiepi ( Л О ( И ) ) 4 - кровь отца (В()(!!! i На рисунке 4 представлены данные ПЦР-ПДРФ на АВО-локусы.

На дорожке 1 - отрицательный контроль (вода), на дорожках 2-4 амниоциты плода, кровь матери и отца соответственно. Как видно из рисунка 4, у матери (дорожка 3) имеются продукты амплификации 3 фрагментов ДНК размерами - 200, 171 и 128 н.п., что соответствует группе крови АО(П). У отца (дорожка 4) после амплификации обнаруживаются 4 фрагмента ДНК размерами - 200, 171, 128 и 88 н.п.

Фрагмент ДНК размером 88 н.п. является специфичным для В-аллеля, фрагмент ДНК размером 171 н.п. соответствует О-аллелю.

Следовательно, у отца группа крови ВО(Ш). У плода (дорожка 2) после амплификации присутствуют фрагменты ДНК размером 171 н.п. и фрагмент размером 128 н. п., что соответствует группе крови ОО(1). Таким образом, в данном случае не возникает риска развития у плода гемолитической болезни при АВО-несовместимости групп крови.

В результате проведенных исследований были определены допустимые пороги нормы по уровню ААТ к НК в сыворотке крови здоровых людей.

На основании полученных норм, при обследовании беременных женщин с различными формами ГБП, были получены результаты, свидетельствующие о достоверном повышении уровня ААТ к РНК в сыворотке крови женщин при ВФ и АФ ГБП. Причем достоверное повышение уровня ААТ к РНК в сыворотке крови женщин при различных формах ГБП наблюдается со 2-й половины беременности. Данное обстоятельство делает весьма информативным и перспективным изучение уровня ААТ к РНК в сыворотке крови бремененных женщин с риском Rh-аллоиммунизации с целью пренатальной диагностики ВФ ГБП. У Rh(-) женщин АВОаллоиммунизация сопровождается наиболее высоким уровнем содержания ААТ к РНК в сыворотке крови. У Rh-конфликтных беременных АВО-несовместимость приводит к дополнительному увеличению уровня содержания ААТ к РНК, чем при Rhаллоиммунизации без АВО-конфликта. Результаты наших исследований показали, что ОАА не влияет на выработку ААТ к РНК в сыворотке крови беременных женщин, то есть предшествующие осложненные беременности не являются возможной причиной присутствия ААТ к РНК в крови. Мы считаем, что все случаи повышения уровня ААТ к РНК являются результатом синтеза ААТ de novo.

Было показано, что выработка ААТ к НК у детей и их матерей происходит по различным направлениям. У матерей преобладают случаи повышенного уровня ААТ к РНК в сыворотке крови, а у их детей - ААТ к дДНК и одновременно к дДНК и нДНК. Практически во всех случаях повышения уровень ААТ к НК в сыворотке крови у детей был выше в 2 и более раза, чем аналогичные показатели у матерей. Нами было сделано предположение, что выработка ААТ к НК у дегей происходила уже до рождения, внутриутробно, независимо от матерей. Причины и механизмы этого феномена требуют отдельных исследований.

Апробированы и применены в клинической практике метод диагностики Rh-статуса и группы крови при помощи ПЦР и ПДРФ Мы считаем, что комплексное определение уровня ААТ к РНК в сыворотке крови женщин со 2-й половины беременности, а также молекулярно-генетическое типирование Rh- и АВО- принадлежности плода, являются необходимыми критериями для точной диагностики ГБП, выбора тактики лечения и оптимальных сроков родоразрешения.

ВЫВОДЫ

1. Пороговые уровни (X ± 2а и X ± Зет) содержания аутоантител к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови здоровых доноров составили (в отн. ед.). к РНК - 0,95±0,50 (р0,05) и 0,95±0,75 (р0,01);

к нДНК - 1,00±0,40 (р0,05) и 1,00±0,60 (р0,01); к дДНК - 1,12±0,40 (р0,05)и 1,12±0,60(р0,01).

2. У здоровых рожениц уровень аутоантител к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови достоверно не отличался от показателей здоровых доноров и составил (в отн. ед.): к РНК - 1,07±0,10; к нДНК к дДНК - 0,98±0,14.

3. У иммуноконфликтных рожениц с внутриутробной и анемической формами гемолитической болезни плода наблюдалось достоверное повышение уровня аугоантител к РНК в сыворотке крови (2,07±0,22 и 1,56±0,18 отн ед. соответственно).

4. Показано, что наблюдаемое со 2-й половины беременности достоверное повышение уровня аутоантител к РНК (1,48±0,10 отн.ед.) в сыворотке крови у женщин с различными формами гемолитической болезни плода не зависит от отягощенного акушерского анамнеза.

5. Аллоиммунизация по АВО-антигенам сопровождается наиболее высоким уровнем содержания аутоантител к РНК в сыворотке крови Rh(-) рожениц (3,55±0,81 отн.ед.). У Rh-конфликтных беременных АВО-несовместимость приводит к дополнительному увеличению уровня содержания аутоантител к РНК (1,96±0,19 отн.ед.), чем при Rh-аллоиммунизации с АВО-совместимостью (1,68±0,12 отн.ед.).

6. Комплексное определение уровня аутоантител к РНК в сыворотке крови женщин с высоким риском аллоиммунизации начиная со 2-й половины беременности, генотипирование резус- и АВО- принадлежности плода методами полимеразной цепной реакции и полиморфизма длины рестрикционных фрагментов необходимы для точной диагностики гемолитической болезни плода, выбора тактики лечения и оптимальных сроков родоразрешения.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ:

Абдрахманова Л.Р., Зайнуллин А.А., Садыков Б.Г., Латыпов 1.

А.Ш. Молекулярно-генетическая диагностика резус-принадлежности плода по околоплодным водами при резус-изоиммунизации // Каз.

Мед. Журнал. -1999. -Т. 80, N 4, -С. 300-301.

Зайнуллин А.А.,

2. Зайнуллина А.С., Саттарова Л.И., Ишмухаметова Д.Г., Винтер В.Г. Иммуноферментное определение антител к РНК на полистироловых планшетах отечественного производства// Биотехнология. - 2000. - N 2. - С. 84-89.

3. Зайнуллин А.А., Абдрахманова Л.Р., Латыпов А.Ш., Кузьмина Л.Ю., Садыков Б.Г. Пренатальная диагностика резус-принадлежности плода молекулярно-генетическим методом // II (IV) российский съезд медицинских генетиков. - Курск, 17-19 мая. - 2000. - С. 104-105.

Самойлова Л.Р., Бубис И.Г., Зайнуллин А.А. Важность 4.

сочетания методов кариологического и гибридизации in situ для уточнения диагноза // II (IV) российский съезд медицинских генетиков. - Курск, 17-19 мая. - 2000. - С. 224-225.

Зайнуллин А.А.

5. Абдрахманова Л.Р., Садыков Б.Г., Ультразвуковые и молекулярно-генетические методы диагностики при резус-изоиммунизированной беременности // Каз. Мед. Журнал. N 5.-С. 427-430.

Abdrachmanova L.R., Sadykov B.C., Zainullin A.A. Moleculargenetical and biochemical methods of the rhesus status // Journal of Reproductive Immunology. Second International Conference on Experimental and Clinical Reproductive Immunobiology, Amsterdam, The Netherlands, 15-18 November. - 2000. - P. 124.

Саттарова Л.И., Зайнуллина А.С., Зайнуллин А.А., Винтер В.Г., 7.

Ишмухаметова Д.Г. Обнаружение антител к РНК в сыворотке крови больных часто рецидивирующей рожей // Юбилейная конференция КНИИЭМ 1900-2000, Материалы конференции: Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и лечения инфекционных и аллергических заболеваний. - Казань, 2000. - С. 62-63.

Абдрахманова Л.Р., Зайнуллин А.А., Зайнуллина А.С. Уровень 8.

антител к нуклеиновым кислотам как иммунологический показатель проницаемости плацентарного барьера и степени поражения гемолитической болезни плода при резус-изоиммунизации // Медицинская иммунология. - 2002. - Т. 4, N 2. - С. 271.




Похожие работы:

«Коммерческое предложение ООО "БИОСМАРТЕКС", специализирующееся на разработке, проектировании, изготовлении и комплектации высокотехнологического оборудования для переработки всех видов биомасс, в высокоэффективное, экологически чистое твердое биотопливо топливные гранулы (пеллеты) и топливные брикеты. Наша компания имеет возможность и...»

«ИННОВАЦИОННОЕ И УСТОЙЧИВОЕ РАЗВИТИЕ Туманова Е.А., к.э.н., и.о. доцента, 502.34+502.36 Униятова О.А., асистент, Национальная академия природоохранного и курортного строительства ПРИНЦИПЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО СТРАХОВАНИЯ Экологическ...»

«ИНСТИТУТ ФИЛОСОФИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК БАРЛЫБАЕВ Х. А.ИЗБРАННЫЕ ТРУДЫ в 4-х томах Том III ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ТЕОРИЯ, ЭКОНОМИКА, ЭКОЛОГИЯ Москва Издательский дом "НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА" УДК 141.3, 304.44 ББК 60.52, 87.6 Б 25 РЕЦЕНЗЕНТЫ: Некипелов А. Д. академик Российской академии наук Муравых А. И. д...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФГБОУ ВПО "ТУВИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" КЫЗЫЛСКИЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ Кафедра педагогики и методики дошкольного и начального образования Роль театрал100€анных игр в экологическом воспитании старших дошкольн...»

«В. В. Зверевич, Н. Е. Прянишников "Зелёный" дизайн современной библиотеки Предложено определение "зелёной" библиотеки. Приведены примеры "зелёных" библиотек. Проанализированы направления деятельности библиотек в области экологии, экодизайна и создания "зелёных" элементов их ин...»

«Зерновые культуры (Выращивание, уборка, доработка и использование) Учебно-практическое руководство Под общей редакцией доктора с.-х. наук, профессора, иностранного члена РАСХН Д. Шпаара 3-е издание, доработанное и дополненное ИД...»

«Николай Фирсов Биологические науки. Словарь терминов. Микробиология "ДРОФА" Фирсов Н. Н. Биологические науки. Словарь терминов. Микробиология / Н. Н. Фирсов — "ДРОФА", 2006 ISBN 5-7107-9001-X Настоящая книга – вторая в серии словарей "Биологические науки".Словарь содержит более 1000 статей, объясняющих часто употребляемые термины...»










 
2017 www.book.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.